この方法により、研究者はマトリックスキューが3D培養中の細胞の表現型にどのように影響するかを体系的に調査することができます。GBM細胞の培養物を用いた手順を実証する。この手法の主な利点は、多くのマトリックス条件をスクリーニングできる高スループットの実装です。
この技術は、腫瘍細胞の薬剤耐性などの細胞培養モデルにおける特定の機能を維持し、潜在的に新しい治療法を同定する組織模倣マトリックスを開発するために使用することができる。この手順を実証するのは、Seidlits Labの学部研究者であるMary EppersonとKelly Tamuraです。
完全なソルベーションの後にpHを7に調整します。HEPES 緩衝溶液に、各グルクロン酸上のカルボン酸残基の 6 ~ 8% が緩衝液中の 1 ミリリットルあたり 10 ミリグラムの濃度でチオールで修飾されるように、チオール化 HA を溶解します。マグネチックスターリングプレートを用いて毎分1,000回転未満で撹拌し、完全に溶解するまで室温で、典型的には約45分間撹拌する。
HAが溶解している間に、8arm PEGノルボルネン1ミリリットル当たり100ミリグラム、4arm PEGチオールの1ミリリットル当たり100ミリグラム、システインまたはシステイン含有ペプチドの4ミリモル、およびLAPのミリリットル当たり4ミリグラムの別々の溶液を微量遠心管に調製する。この時点で単一のヒドロゲル内で連結されるすべてのペプチドの4ミリモル溶液を調製する。HA、PEGノルボルネン、PEGチオール、およびシステインチオール含有ペプチドの個々の溶液を混合して、最終ヒドロゲルマトリックスの最終濃度を達成する。
磁気階段板上で毎分1,000回転未満で少なくとも30分間攪拌し、完全に混合する。サンプルを照明装置に合わせ、シリコーンモールドまたは384ウェルプレートの単一列の他のすべてのLEDと整列させます。UV LEDパラメータを開き、強度と照明の値を入力します。
次に、[完了]をクリックして照明を開始します。照明に続いて、1つのコーナーに置かれたら、ウェルプレートを次のコーナーに移動して繰り返します。プレートのもう一方の半分のウェルを照らすには、プレートをホルダーから持ち上げて 180 度回転させます。
さまざまなメカニズムでヒドロゲルを生成するには、テープを使用してスライドガラスとシリコーンモールドを洗浄し、破片を除去することから始めます。シリコーンモールドをスライドガラスに接着し、押し下げて良好なシールを確保し、気泡を置換します。次に、80マイクロリットルのヒドロゲル前駆体溶液をスライドガラス上の各シリコーンモールドにピペットする。
スライドガラスを、1つの列の他のすべてのLEDと整列した照明装置の上に置きます。ヒドロゲル前駆体をUV光に15秒間暴露し、光架橋する。照明が止まったら、スライドを取り出し、金型の内周を細かい先端でなぞって金型からゲルを緩めます。
ピンセットや鉗子でシリコーンモールドを取り外します。12 ウェルプレートに 2 ミリリットルの DPBS を充填します。架橋ヒドロゲルを個々のウェルプレートに移動するには、ヘラを濡らし、スライドガラスから静かに押し出します。
所望の細胞を単一細胞溶液として調製する。直径約150マイクロメートルの膠芽腫スフェロイドをT-75フラスコ浮遊培養物から15ミリリットルの円錐管に集める。培養フラスコを5ミリリットルのDPBSですすぎ、残留細胞および培地を除去し、この容量を円錐管に加える。
細胞を含む円錐管を室温で5分間200倍Gで遠心分離する。遠心分離後、5ミリリットルの血清学的ピペットで上清を取り除き、細胞ペレットを乱さないように注意し、5ミリリットルのDPBSに再懸濁する。室温で5分間、200倍Gで遠心分離し、細胞を洗浄した。
細胞ペレットを乱さないように注意しながら、5ミリリットルの血清学的ピペットで上清を吸引し、次いで細胞を2ミリリットルの細胞解離試薬に再懸濁する。室温で10〜15分間インキュベートする。3ミリリットルの完全培地と軽くピペットを3〜5回加えて、スフェロイドを単一細胞懸濁液に分解する。
この単一細胞懸濁液を400倍Gで5分間遠心分離し、室温で細胞をペレット化する。上清を5ミリリットルの血清学的ピペットで吸引し、細胞ペレットを乱さないように注意してください。細胞を1ミリリットルの完全培地に再懸濁する。
血球計数器を用いて計数のために細胞の一部を除去する。この部分をトリパンブルーで2倍に希釈し、生存率が損なわれた細胞に浸透させる。生きた無色の細胞だけを数えます。
カプセル化に必要なセルの数を決定します。必要な細胞の総数を含む大量の培地を滅菌1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移す。Gの400倍で室温で5分間スピンダウンします。
上清をマイクロピペットで吸引し、細胞ペレットを乱さないように注意する。細胞ペレットをヒドロゲル前駆体溶液に再懸濁し、1,000マイクロリットルのマイクロピペットで上下にピペッティングして4~5回よく混合する。セルを10マイクロリットルを分配するように設定された繰り返しピペッターにロードします。
気泡や不均一な分配を避けるために、廃棄物容器にさらに1〜2回分配することによって、繰り返しピペッターをプライミングする。384ウェルプレートの各ウェルに、ヒドロゲル溶液に懸濁した10マイクロリットルの細胞を反復ピペッターから分注する。LEDアレイを使用して、セルを含む各ウェルを15秒間照明し、所望の機械的特性を達成する。
細胞を含む各ウェルに40マイクロリットルの完全培地を加える。50マイクロリットルのDPBSをゲルを囲む非実験用ドライウェルに追加して、蒸発による損失を最小限に抑えます。膠芽腫細胞の場合、封入の3日後に開始して、最終的な所望の濃度を達成するために40マイクロリットルの培地含有薬物を添加する。
細胞を含む各ウェルに10マイクロリットルのCCK8試薬を加える。製造業者の指示に従って、1〜4時間インキュベートする。インキュベーション後のすべてのウェルについて、450ナノメートルでの吸光度を読み取ります。
単一のヒドロゲルの表面におけるミクロンスケール領域のAFM調査は、より柔らかい平均ヤング率を有するヒドロゲルも、より硬いヒドロゲルよりも小さいモジュライの範囲を有することを示した。1ミリリットル当たり2,500,000細胞の密度で播種したGS122細胞の3D培養は、1ミリリットル当たり500,000細胞の密度で播種したものと比較して、培養7日後に評価した場合、実質的に高い生存率を示した。GS122細胞は、オステオポンチン由来ペプチドをマトリックスに含めた場合、8キロパスカル条件下で生存率向上を示したが、インテグリン結合シアロタンパク質またはテナシンC由来ペプチドの組み込みは、ショウガRGDペプチドを用いた培養およびマトリックスなどの生存利益を最小限に抑えた。
対照的に、0.8キロパスカル培養条件下で生存率向上を与えたペプチドはなかった。GS122およびGS304細胞はいずれも、RGD含有ペプチドを含む軟質または硬質ヒドロゲルマトリックス中で培養すると広がる。GS122細胞は、オステオポンチンを含む0.8および8キロパスカルの両方で同様の広がりの欠如を示す。
しかし、GS122は、8キロパスカルの状態においてのみテモゾロミドに対する増強された耐性を示した。最後に、この小型化された3D培養プラットフォームは、末期分化した神経内分泌前立腺癌細胞の生存可能なオルガノイドを含む、他の腫瘍型からのヒト細胞を培養するために使用することができる。この手順に続いて、単一細胞RNAシーケンシングなどのさらなる技術を使用して、細胞表現型をさらに特徴付けることができる。
