反応に酵素を触媒として使用すると、反応に必要なエネルギー量を減らし、有毒な副産物を減らすことができます。しかし、酵素は安定しておらず、高価であり得るため、産業における酵素の使用は限られている。このプロトコルは、条件が酵素活性に有害であるかどうかを判断するためにかかる時間、または酵素への修飾がその安定性を増加したかどうかを判断するのにかかる時間を減らすことができます。
この技術の主な利点は、従来の酵素安定性アッセイよりも少ない時間を必要とすることです。さらに、このプロトコルは、熱を放出または吸収する任意の反応で使用することができるので、酵素の広い範囲で使用することができます。開始するには、0.1酢酸ナトリウムの大臼歯を調製します。
1,000ミリリットルの段階的なビーカーで蒸留水の800ミリリットルを測定します。その後、8.2グラムの無水酢酸ナトリウムを秤量し、ビーカーに加えます。ビーカーを攪拌板の上に置きます。
ビーカーに攪拌棒を入れ、攪拌板をオンにして完全に溶解するまでかき混ぜます。無水酢酸ナトリウムが完全に溶解したら、較正されたpHメーターを使用して溶液のpHを測定する。ピペットを使用して、4.6で所望のpHを得るために、それに応じて1モル塩酸または水酸化ナトリウムを加えます。
総体積が1,000ミリリットルに達するまで、蒸留水をビーカーに加えます。酵素溶液を調製するために、15ミリリットルの段階的なシリンダーで、0.1酢酸ナトリウム緩衝液の8ミリリットルを測定する。その後、酵素を用いて15ミリリットルの円錐管に緩衝液を加え、酵素が溶解するまで激しく振る。
総体積が10ミリリットルに達するまで、より多くのバッファー溶液を追加します。酵素溶液は使用するまで摂氏4度で保存します。基質溶液を調製するには、基板を計量し、100ミリリットルのガラスビーカーに入れます。
段階的なシリンダーを使用してバッファー溶液の20ミリリットルを測定し、ガラスビーカーに追加します。ビーカーを攪拌プレートに置き、ビーカーに磁気攪拌棒を入れる。火をつけて、それに応じて攪拌速度を調整します。
基材が溶解するまで撹拌を続けます。基質溶液を15ミリリットル円錐形チューブに注ぎ、前に調製した酢酸ナトリウム緩衝液を加え、全容量が45ミリリットルになるまで添加する。チューブを振って混ぜます。
使用するまで、基板溶液を室温で保管してください。コンピュータで、[ITC の実行] を開き、[セットアップ] をクリックします。撹拌速度をクリックし、350rpmに設定します。
シリンジサイズが50マイクロリットルであることを確認してください。温度を摂氏55度に設定し、更新を押します。ITC機器が必要に応じて加熱または冷却するのに十分な時間を与えるために、続行する前に少なくとも1時間待ちます。
酵素をロードする前に、参照セルに350マイクロリットルの蒸留水がロードされていることを確認してください。サンプルセルを洗浄するには、2%の洗浄液を500マイクロリットルで充填します。慎重にサンプルセルに針を挿入し、細胞を満たし、同じ注射器を使用してゆっくりと液体を取り除きます。
ビーカーに液体を処分します。このステップを2%洗浄液で2回、エタノール70%で3回繰り返し、蒸留水で10回洗浄します。サンプルセルを洗浄した後、450マイクロリットルの酵素溶液で装填注射器を充填します。
慎重にサンプルセルの底まで針を挿入し、気泡の形成を防ぐために100マイクロリットルラインまでゆっくりとプランジャーを押し下げる。その後、50マイクロリットルの滴定シリンジを水に針先を入れて3回蒸留水で洗浄し、水をゆっくりとシリンジに取り込み、水を廃液に分配します。基質溶液で3回リンスし、残留水を除去する。
その後、滴定シリンジを、気泡なしでシリンジが満杯になるまで溶液を引き上げて、基質溶液で充填する。シリンジを基板溶液に残したまま、プランジャーを取り外し、約2マイクロリットルの空気がシリンジの上部に入り、プランジャーを再挿入します。ITCのビュレットハンドルを取り外し、ビュレットハンドルの内側に注射器を置き、ネジを締め付けます。
滴定シリンジの先端を糸くずのないティッシュで拭き取り、それから慎重にITCの器械にビュレットのハンドルを置き、それを所定の位置にロックする。実験の設定で、増分滴定を選択します。挿入をクリックして、挿入を設定します。
射出間隔を5、400秒、注入量を4マイクロリットル、注射回数を4に調整します。[OK] をクリックして設定を確認します。平衡ボックスで、自動平衡化と大きな予想熱を選択します。
初期ベースラインを 300 秒に設定します。実行を開始するには、攪拌速度の横にある開始記号をクリックし、レンチ記号の横にある開始ボタンをクリックします。ファイルを保存し、インストゥルメントの実行を許可します。
データを分析するには、ナノ分析でファイルを開きます。[データ] をクリックし、データ列を選択します。すべてのデータを選択し、コピーして、Excel に貼り付けます。
0 にする必要がある値を 300 秒に加算して、0 のベースラインを調整します。この補正を熱レート値の列全体に適用します。次に、滴定中に発生した時間に対する最小値または最大値のグラフをプロットします。
このプロトコルでは、ラクターゼ活性のITCデータトレースは、55°C、摂氏45度、摂氏35度、摂氏25度のpH 4.6バッファでラクターゼ溶液にラクトーゼの4回の連続注入で示されている。混合熱のため、55°Cで酵素制御を行なった。酵素の注入ごとに、混合の初期発熱熱があり、その後、ラクトースのラクターゼ触媒吸水分解が反応が完了するまで起こり、熱速度はベースラインに戻る。
各注射後の吸気ピーク最小値は、酵素活性の低下のために前噴射よりも少し少ない。予想通り、各注入の酵素安定性は温度の上昇に伴って低下する。コントロール実験は、4回の注射後の希釈のために、摂氏25度のラクターゼ活性が酵素活性の8%減少したことを示している。
4回目の注射はアッセイの73%の減少を示すことを考えると、酵素活性の実際の損失は65%であった。したがって、各注射から生じるラクターゼの希釈は、酵素活性に対して11%の比較的小さな効果を有していた。酵素と基質溶液を作るために使用されるバッファーができるだけ密接に一致することが重要です。
pHまたは濃度の不一致は、反応熱をマスクすることができる混合のより大きな熱をもたらすことができます。このプロトコルを適用して酵素を研究し、反応の過程で放出または吸収される熱の速度を測定することによって、その安定性を決定することができます。
