반응에 촉매로 효소를 사용 하 여 반응에 필요한 에너지의 양을 줄일 수 있습니다., 독성 부산물을 줄일 수 있습니다. 그러나, 산업에서 효소의 사용은 제한적이다, 효소가 안정적이지 않고 비용이 많이 들 수 있기 때문에. 이 프로토콜은 조건이 효소 활동에 해로운지, 또는 효소에 대한 수정이 안정성을 증가시키는지 결정하는 데 걸리는 시간을 줄일 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 전통적인 효소 안정성 에세이보다 더 적은 수의 사람이 필요하다는 것입니다. 또한,이 프로토콜은 열을 방출하거나 흡수하는 모든 반응과 함께 사용할 수 있기 때문에 광범위한 효소와 함께 사용할 수 있습니다. 시작하려면 0.1 어금니 나트륨 아세테이트 버퍼를 준비하십시오.
1, 000 밀리리터 졸업 비커에 증류수 800 밀리리터를 측정합니다. 그런 다음 8.2 그램의 무수성 아세테이트의 무게를 측정하고 비커에 추가합니다. 비커를 교반 접시에 놓습니다.
교반 봉을 비커에 넣고 저어접시를 켜서 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 무수성 아세테이트 나트륨이 완전히 용해되면 보정된 pH 미터를 사용하여 용액의 pH를 측정합니다. 파이펫을 사용하여 4.6에서 원하는 pH를 얻기 위해 그에 따라 1 개의 어금다 산 또는 수산화 나트륨을 첨가하십시오.
총 부피가 1, 000 밀리리터에 도달할 때까지 증류수를 비커에 넣습니다. 효소 용액을 준비하려면 15 밀리리터 졸업 실린더에서 0.1 어금니 나트륨 아세테이트 버퍼의 8 밀리리터를 측정합니다. 그런 다음 완충액을 효소로 15 밀리리터 원내 튜브에 넣고 효소가 용해될 때까지 힘차게 흔들어 줍니다.
총 볼륨이 10 밀리리터에 도달할 때까지 버퍼 솔루션을 더 추가합니다. 사용 전까지 효소 용액을 섭씨 4도에 보관하십시오. 기판 용액을 준비하려면 기판을 계량하고 100 밀리리터 유리 비커에 넣습니다.
완성된 실린더를 사용하여 버퍼 용액의 20밀리리터를 측정한 다음 유리 비커에 추가합니다. 비커를 교반판에 놓고 자기 교반 봉을 비커에 넣습니다. 열을 켜고 그에 따라 교반 속도를 조정합니다.
기판이 용해될 때까지 교반을 계속할 수 있습니다. 기판 용액을 15밀리리터 원모 튜브에 붓고, 총 부피가 45밀리리터가 될 때까지 이전에 준비된 아세테이트 나트륨 버퍼를 추가합니다. 튜브를 흔들어 섞어 줍니다.
기판 용액을 실온에 보관하여 사용할 때까지 보관하십시오. 컴퓨터에서 ITC 실행을 열고 설정을 클릭합니다. 교반 속도를 클릭하고 350 rpm으로 설정합니다.
주사기 크기가 50 마이크로 리터에 있는지 확인하십시오. 온도를 섭씨 55도로 설정하고 업데이트를 누릅니다. ITC 기기가 필요에 따라 가열하거나 냉각할 수 있도록 진행하기 전에 최소 한 시간 이상 기다립니다.
효소를 적재하기 전에 기준 셀에 증류수 350 마이크로리터가 적재되어 있는지 확인하십시오. 샘플 셀을 청소하려면 2% 세척 용액의 500 마이크로리터로 적재 주사기를 채웁니다. 조심스럽게 샘플 셀에 바늘을 삽입, 세포를 채우고, 천천히 같은 주사기를 사용하여 액체를 제거.
액체를 비커에 넣습니다. 이 단계를 2% 세척 용액으로 두 번 반복하고, 70%의 에탄올로 3회, 증류수로 10회 세척합니다. 샘플 셀을 세척한 후 450마이크로리터의 효소 용액으로 적재 주사기를 채웁니다.
조심스럽게 시료 세포의 바닥에 모든 방법을 바늘을 삽입하고 천천히 기포의 형성을 방지하기 위해 100 마이크로 리터 라인아래로 플런저를 누릅니다. 그런 다음 바늘 끝을 물에 넣고 천천히 물을 주사기로 가져 간 다음 물을 폐기물 용기에 분배하여 증류수로 50 마이크로 리터 적정 주사기를 세 번 씻으십시오. 잔류수를 제거하기 위해 기판 용액으로 세 번 헹구는 다.
그 후, 주사기가 기포없이 가득 차 때까지 용액을 끌어서 기판 용액으로 적정 주사를 채웁니다. 기판 용액에 여전히 주사기를 사용하면 플런저를 제거하고 약 2 마이크로리터의 공기가 주사기의 맨 위에 들어가 플런저를 다시 삽입할 수 있습니다. ITC의 버렛 핸들을 제거하고 주사기를 버렛 손잡이 안에 놓고 꽉 다할 때까지 나사를 놓습니다.
무분별한 티슈로 적정 주사기의 끝을 닦은 다음, 조심스럽게 BURETTE 핸들을 ITC 기기에 넣고 제자리에 잠급합니다. 실험 설정의 경우 증분 적도를 선택합니다. 삽입을 클릭하여 주사를 설정합니다.
사출 간격을 5, 400초로 조정하고, 주사부도 4마이크로리터로, 주사 수를 4개로 조정한다. 확인을 눌러 설정을 확인합니다. 평형 상자에서 자동 평형과 예상 열을 선택합니다.
초기 기준선을 300초로 설정합니다. 실행을 시작하려면 교반 속도 옆에 있는 시작 기호를 클릭한 다음 렌치 기호 옆에 있는 시작을 클릭합니다. 파일을 저장하고 계측기를 실행하도록 허용합니다.
데이터를 분석하려면 나노 분석에서 파일을 엽니다. 데이터를 클릭하고 데이터 열을 선택합니다. 모든 데이터를 선택하고 복사한 다음 데이터를 Microsoft Excel에 붙여 넣습니다.
0을 만들기 위해 300초에 필요한 값을 추가하여 기준선 0을 조정합니다. 열속도 값의 전체 열에 이 수정을 적용합니다. 그런 다음 적정 중에 값이 발생한 시간에 대해 최소 값 또는 최대 값의 그래프를 플롯합니다.
이 프로토콜에서, lactase 활동의 ITC 데이터 추적은 55섭씨, 섭씨 45도, 섭씨 35도 및 섭씨 25도에서 pH 4.6 완충액에 락타제 용액에 4개의 순차적으로 주사하는 것으로 표시됩니다. 혼합의 열을 위해 55°C에서 효소 조절이 수행되지 않았습니다. 효소의 각 주입에 대해, 혼합의 초기 외열이 있고, 그 후, 락타제 촉매 인외성 인더리움 의 유당 가수 분해는 반응이 완료될 때까지 발생하며, 열속도는 기준선으로 반환된다.
각 주사 다음 의 외열성 피크 최소, 효소 활성의 감소 로 인해 이전 주입 보다 조금 적은. 예상대로, 각 주사에 대한 효소 안정성은 온도 가 증가함에 따라 감소합니다. 대조군 실험은 25°C에서 락타제 활성을 보여 주며 4개의 주사 후 희석으로 인해 효소 활성이 8% 감소했습니다.
네 번째 주사를 고려하면 분석에서 73 % 감소를 나타내며, 효소 활성의 실제 손실은 65 %였습니다. 따라서, 각 주사에서 유래된 락타제의 희석은 효소 활성에 11%의 비교적 작은 효과를 가졌다. 효소 및 기판 용액을 만드는 데 사용되는 버퍼가 가능한 한 밀접하게 일치하는 것이 중요합니다.
pH 또는 농도의 불일치는 반응 열을 마스크 할 수있는 혼합의 더 큰 열을 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜을 효소 연구에 적용하고 반응 과정에서 방출또는 흡수되는 열 속도를 측정하여 안정성을 결정할 수 있습니다.
