標的関与の評価、すなわち、それが設計されたタンパク質との薬物の相互作用は、薬物開発における、または基礎研究プロジェクトにおけるあらゆる化合物の生物学的活性の解釈のための基本的な要件である。この技術の主な利点は、ヒストンマークや発現などの下流効果の測定ではなく、KDM1Aターゲットエンゲージメントの用量効果とダイナミクスを直接測定できる点です。この技術は、基礎研究および臨床試験、腫瘍学的CNSまたはKDM1A阻害剤による治療を受ける他の疾患において薬力学を研究するために適用することができる。
この技術は、ORY-1001、iadademstatを研究するために開発されたケモプローブに基づいていますが、実際には他のKDM1A阻害剤に使用することができ、戦略は他のターゲットに適用することができます。この手順は、私の研究室のPK/PD発見プラットフォームのオペレーションマネージャーであるRaquel Ruizによって実証されます。ORY-1001での細胞処理の間に、化合物は核内に存在するKDM1Aタンパク質に結合する。
この手順を開始するには、冷蔵庫から20ミリモルビチン化プローブOG-881ストック溶液の10マイクロリットルの単独使用アリコートを冷蔵庫から取り出し、室温で10分間温めます。フィルターチップを含むマイクロパイプを使用して、ストック溶液を連続して希釈し、2つのマイクロモル作動溶液を調製します。次に、1錠のプロテアーゼ阻害剤をPBSの1ミリリットルにマイクロ遠心分離チューブに溶解する。
1x細胞溶解バッファーの所望量の各ミリリットルに対して、10x細胞溶解バッファーを得た市販の100マイクロリットル、10xプロテアーゼ阻害剤の150マイクロリットル、2つのマイクロモルOG-881作業溶液の12.5マイクロモルOG-881の12.5マイクロリットルおよび737.5マイクロリットルの二重蒸留水を混合する。細胞は、任意の遊離KDM1Aタンパク質に結合するケモプローブの存在下で1xリシスバッファーにリセ化される。組織から準備するには、乾燥氷の上で冷やされたモルタルと害虫を使用して、1立方センチメートルの凍結組織を粉砕し、均質化します。
アリクォートは、組織を使い捨てバイアルに入れ、常に解凍を避けながら、各バイアルに約40ミリグラムの組織粉末を確実に移す。処理の準備ができるまで、サンプルを摂氏80度で保存します。細胞ペレットから調製するために、25ナノモルOG-881を含む1x細胞のライシス緩衝液の200マイクロリットルで約1000万個の細胞のペレットを再懸濁する。
各サンプルを短く渦を出し、5分間氷の上に置いておきます。超音波処理器を使用して、それぞれ20秒間持続する45キロヘルツで3パルスでサンプルを超音波処理します。パルスの間に20秒間氷の上にサンプルを置きます。
さらに5分間氷の上にサンプルを保管してください。その後、摂氏4度で予冷した遠心分離機で14,000倍Gのサンプルを14,000倍にして遠心分離する。1ミリリットルマイクロピペットを使用して、各上清を別々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。
チューブを氷の上に2時間放置してから処理します。次に、テキストプロトコルに概説されているように、ブラッドフォードアッセイを用いて天然タンパク質を定量化する。全板は抗KDM1A抗体でコーティングされています。
フリープレートはストレプトアビジンでコーティングされています。細胞ライセートは、その後、両方のプレートに添加され、KDM1A複合体は直接またはケモプローブを介して捕捉される。プレートを洗浄し、抗KDM1A検出抗体と二次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合してインキュベートします。
最後に、発光基材を添加し、信号を生成する。総KDM1A ELISAの場合、PBSで10ミリリットルのKDM1A捕捉抗体を、各プレートに対して1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度に調製します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。
遊離KDM1A ELISAの場合、各プレートに対して1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度としてPBSでストレプトアビジン10ミリリットルを調製します。プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。その後、各プレートを粘着フィルムで上部密封し、摂氏4度で一晩インキュベートする。
翌日、冷蔵庫からプレートを取り出し、室温で約45分間平衡させます。各プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ステップごとにペーパータオルのプレートをタップして残留液を取り除きます。両方のプレートの各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。
上部は、粘着フィルムでプレートを密封し、室温で2時間インキュベートします。一方、先に得られた天然タンパク質抽出物をPBSで適切な濃度に希釈し、テキストプロトコルで概説されているようにヒトrKDM1Aを用いて標準曲線を調製するプレートをレイアウトする。2時間のインキュベーションが完了したら、ブロッキングバッファを捨てて洗浄バッファでプレートを洗い、洗浄ステップの後にペーパータオルのプレートをタップして残留液を取り除きます。
テキストプロトコルの表2にあるプレート分布に従って、適切な希釈サンプルを冷蔵96深井戸貯蔵ブロックに移します。このブロックを氷の上に置き、テキストプロトコルの表3に見られるプレート分布に続いて、1ウェル当たり100マイクロリットルを合計および無料のELISAプレートにピペット化します。室温で1時間インキュベートし、サンプルを捨てて洗浄バッファーで5回洗浄します。
1ミリリットル当たり0.125マイクログラムの濃度でブロッキングバッファーにウサギの抗KDM1A検出抗体の20ミリリットルを調製します。陰性対照に対応するものを除き、検出抗体溶液の100マイクロリットルを両方のプレートの各ウェルに加える。上部は、粘着フィルムでプレートを密封し、室温で1時間インキュベートします。
この後、検出抗体溶液を廃棄し、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。25ミリリットルの二次ヤギ抗ウサギ抗体を調製し、HRP、ブロッキング緩衝液中の1〜5,000の希釈にする。マイクロタイタープレートの各ウェルに二次抗体溶液100マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートします。
このインキュベーション終了の30分前に、柔らかい光の条件下でアンバーボトルにルミノールエンハンサーと過酸化物溶液の等しい部分を混ぜます。この混合物は室温のままにしておきます。1時間のインキュベーションが完了したら、二次抗体溶液を捨て、洗浄バッファーでプレートを6回洗浄します。
次に、100マイクロリットルのルミノール作動液をプレートの各ウェルにピペットし、気泡形成を避けるために非常にゆっくりとピペット化することを確認する。タイマーを使用して、溶液の添加とプレートの発光測定までの時間を制御し、この時間を一定に保ち、アッセイ間の再現性を高めます。上部は、接着剤フィルムと遠心分離機でプレートを500倍Gで、室温で45秒間シールし、残りの気泡を除去します。
プレートを100 rpmでプレートシェーカーに1分間インキュベートします。その後、粘着フィルムを取り出し、プレートをマイクロプレートリーダーに挿入し、3分間放置して摂氏25度で温度を安定させます。各ELISAプレートアッセイの相対発光単位を読み取る。
詳細な分析のために、生の RLU 値を生データ・スプレッドシート・ファイルから保存してコピーします。本研究では、新しいKDM1Aケモプローブ捕捉ベースのELISAを使用して、細胞および組織サンプルにおけるKDM1A標的関与を直接測定する。合計およびフリー rKDM1A の RLU 値が評価され、直線性が検証されます。
その後、3人の独立したボランティアからヒトのPBMCで検出された合計および遊離KDM1AのRLU値が標準曲線に重ね合わされます。AML細胞は、プロバイダの推奨に従って培養され、異なる濃度で車両またはORY-1001のいずれかで処理されます。天然タンパク質抽出物は、25ミリモルのOG-881ケモプローブの存在下で得られ、0.5マイクログラムの全タンパク質が標的エンゲージメントの分析を行うために使用されます。
その後、合計および無料のKDM1Aが決定され、ORY-1001からKDM1Aへの目標関与の割合が車両に対して相対的に計算されます。PBMCsにおける用量応答性KDM1A標的関与および経口ギャバジによるORY-1001を有するラットの肺治療において、その車両群に対して計算された相対値がここに示されている。このエクスビボインキュベーションは、車両処理動物からの肺タンパク質抽出物25ナノモルORY-1001を用いて、完全なTEを生み出すが、それでも、1キログラム当たり30マイクログラムで4日間治療されたラットからのサンプル中のTEをさらに増加させないが、KDM1Aが既に生体内で完全に阻害されたことを確認した。
このプロトコルは、KDM1Aの目標を、無料および合計KDM1Aを測定することによって評価します。それはネイティブタンパク質抽出を必要とします覚えておいてください.この技術は、特定の阻害剤を評価するために異なる種からのサンプルに使用することができ、また、新しい阻害剤をスクリーニングする。
この研究で使用されるケモプローブは、KDM1A相互作用を研究するためにケモプロテオミクスに適用することもできる。KDM1A阻害剤のような生体試料や生物活性化合物を取り扱う際には、常に安全に作業し、常に予防策を尊重することを忘れないでください。
