脳と腸内微生物叢の間の同時性と線の相互作用は不明のままである。この技術を用いて、マウスにおける外傷性脳損傷後の腸内微生物叢における変化を調べることができる。この手法の主な利点は、比較的シンプルで効率的なことです。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるWendong Youです。外傷性脳損傷誘導については、麻酔をかけマウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を適用する。剃った後、サジタル面で頭皮を切開する前に、露出した頭皮の皮膚を70%エタノールで消毒します。
鉗子を使用して、両側の切開を引き込み、骨膜をわずかに分離する。マーカーを使用して、正線から 2 ミリメートル離れた頭蓋骨の右頭頂部に直径 3 ミリメートルの円を描画します。硬膜を傷つけることなく、慎重に頭蓋骨を貫通するために電気ドリルを使用してください。
骨フラップを取り外して3ミリメートルの骨窓を露出させ、開頭術の上にプラスチック損傷カニューレを置きます。歯のアクリルで頭蓋骨にカニューレを固めた後、5ミリリットルの注射器を使用して、泡を避けるために、無菌0.9%正常生理食塩水でカニューレを充填します。オシロスコープとアンプをオンにします。
横流の流体打楽器損傷装置の高圧管に気泡が含まれ、約10個のテストパルスを供給し、安定した信号が出るまで確認します。振り子の開始位置の角度を調整して、約2つの標準雰囲気のパルス強度に達し、損傷カニューレを横流の流体パーカッション傷害装置に接続します。トリガーを引いて振り子を解放し、脳損傷を誘発する。
次に、閉じた流体充填チューブシステム全体を通して、デュラにパルスを送ります。脳損傷の誘導後、カニューレを取り除き、切開を縫合する。その後、マウスを外来になるまで監視付きの加熱パッドにマウスを置き、動物を食物と水へのアドリビタムアクセスで自宅のケージに戻します。
示された実験時に、標準的なプロトコルに従って腸を露出させ、非外傷性鉗子を使用して、他の腸管からカエカムを穏やかに分離する。組織が見つかったら、尖ったはさみでカエカムを切断し、手動で無菌ドレッシングにカエカムの内容物を抽出します。その後、マイクロバイオーム分析までマイナス80°Cの貯蔵のために、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに内容物を移します。
16S組換えDNAシーケンシングは、外傷性脳損傷の3日後にマウスにおけるカエカム微生物叢の多様性の減少を示し、この図に示されている恥および外傷性脳損傷群のケカム内容物内で最も豊富な分類を有する。さらに、非メトリック、多次元スケーリングは、外傷性脳損傷後のカエカム微生物叢の組成の変化を明らかにする。頭蓋骨を掘削するときには硬膜をそのままに保ち、他の腸管からカエカムを見つけて分離するときに穏やかであることを忘れないでください。
この手順に従って、ヘマトキシリンおよびエオシン染色および分析を行い、外傷性脳損傷後の腸管内の組織学的変化および炎症反応を調べることができる。
