この方法を使用すると、マウス胚のさらなる実験的操作なしに、心臓管形成、ループ、および完全なチャンバー形成を直接検査することができます。一例としてMLC-2v-tdTomatoマウスを用いるが、この簡便な方法は他の蛍光レポーターマウスラインと広く用いることができる。このプロトコルの主な利点は、非常に単純であり、任意の複雑な技術や機器を必要としないことです。
通常のラボ設定で実行できます。生後8~10週のMLC-2v-tdTomatoの雌を雄マウスと交配した後、ダムで毎朝膣プラグを確認する。妊娠したダムを置き、結腸後の異なる日に安楽死させ、仰向けの位置に、腹部に70%エタノールを噴霧する。
皮膚と腹壁の両方の切開によって腹腔を開くために鋭い外科用ハサミと鉗子を使用してください。腹腔の後部に両側の子宮の角を見つけ、鋭い外科用ハサミと鉗子を使用して子宮全体を分離し、両側の卵管の上に慎重に切断する。解剖した子宮全体を氷冷PBSで10センチメートルのシャーレに入れます。
鋭利な外科用ハサミと鉗子を使用して、子宮の角に沿って各羊膜嚢を慎重に分離する。ピンセットを使用して、各胚を氷冷PBSで満たされた35ミリメートルの培養プレートに移します。鋭利な外科用ハサミと鉗子を使用して、羊膜嚢を開き、臍帯を切断して各胚を露出させ、胚を損傷することなく可能な限り余分な胚組織をトリミングする。
光ファイバー顕微鏡照明器を用いた解剖顕微鏡の下で、胚の頭部を切断し、100マイクロリットルの緩衝液Aを有する1.5ミリリットルのチューブに移し、後のジェノタイピングは蛍光イメージングの結果と相関させる。細かい鉗子を使って、胚の胸部を開く。鋭利な手術用ハサミと鉗子で、肺と脈管から心臓を取り除きます。
ピンセットを使用して、解剖した胚心臓をPBSで35ミリメートル培養プレートに移します。マウス胚性心臓を用いてプレートを蛍光解剖顕微鏡の下に置きます。発達中の心室が試験官に向かうような胚性心臓を配置するために細かい鉗子を使用する。
明視野モードで0.63xの目標を使用してフォーカスを調整します。明視野露出を取り、複数の画像をキャプチャします。tdTomatoの発現を可視化するには、光ファイバー顕微鏡の照明をオフにして、赤い蛍光のフィルターをセットします。
必要に応じて画像の再調整、明るさとコントラストの調整、赤蛍光露出の撮影、複数の画像のキャプチャを行います。胚のジェノタイピングの場合、以前に分離された頭部サンプルを100°Cで摂氏100度で30分間沸騰させる。遠心分離機は11で2分間、360倍G.20マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、20マイクロリットルのバッファーBと混合します。
DNAテンプレートとして4.5マイクロスプリナを使用し、10マイクロモル特異的なフォワードおよびリバースプライマー、2xプレミックスポリメラーゼおよび反応バッファーの10マイクロリットルのそれぞれ0.5マイクロリットルと組み合わせて、合計20マイクロリットルに水を加えます。原稿に記載されているとおりに PCR を実行します。完成した反応を1%アガロースゲルに100塩基対DNAラダーでロードし、1x TAEバッファーで140ボルトで25分間実行します。
完成したゲルをUVトランイルミエーターに置き、UV光をオンにしてDNAバンドを識別します。MLC-2vは、心臓の発達中に心室室の仕様のための最も初期のマーカーであると考えられる。MLC-2v-tdTomatoレポーターノックインマウスでは、E8.0のリニア心臓管におけるtdTomatoの比較的弱い発現は、胚の全マウントエピロウのイメージングを用いて示されるようにE8.5において強くなる。
解剖された心臓の全マウントエピフラワー画像を使用して、マウス心臓の発達中の心室形成を容易に決定することができる。E10.5でマウス胚全体から解剖された心臓では、MLC-2v-tdTomatoレポーターの発現は、心臓の心室部分に示され、血流路、流出路、または将来のアトリアには示されなかった。E12.5~E13.5では、tdTomatoレポーターは4室の心臓の心室で独占的に表現される。
同様の心室特異的発現パターンは、E16.5における解剖マウス胚に示された。全体のイメージングの後、胚の遺伝子型をPCR遺伝子型化のためのプライマーの2組を用いて決定し、tdTomatoノックインアレーレ、ヘテロ接合、および野生型胚を運ぶホモ接合性胚を確認した。この方法は非常に簡単で、実行が簡単です。
重要なステップは、胚性心臓を解剖することです。心臓の発達中に心臓解剖学を理解することは、胚全体から心臓を正常に分離するために必要である。
