このプロトコルは、先天性心疾患を診断するための高解像度画像データを生成するための最先端の方法を概説しています。非侵襲的胎児心エコー検査と剖検、それに続くエピスコパル共焦点顕微鏡組織病理学による機能評価を行い、シリアル2D画像スタックと3D再構成を生成し、包括的なCHD診断を行います。この方法は、先天性心疾患における詳細な解剖学的変化を解明するだけでなく、頭蓋顔面欠損、四肢および骨格異常、ならびに脳および他の内臓の欠陥を含む他の臓器の構造的先天性欠損症の調査にも使用できます。
これらの手順を実演するのは、私たちの研究室のすべての研究者であるメーガン・ホルブルック、カーラ・グズマン、ペイジャオ・チャン、ベンジャミン・グレノンです。手順のためにマウスを準備した後、超音波ゲルを体温まで温め、イメージング領域にたっぷりと適用します。次に、トランスデューサーを水平面に向けられた腹部に置き、画面上の膀胱を特定します。
膀胱が特定されたら、膀胱から頭蓋をスキャンし、胎児を探し、クラウンからランプの長さを測定して妊娠期間を決定します。次に、カラードップラーを使用して心臓からの血流を分析します。内臓への固定液の浸透を可能にするには、鉗子または解剖ハサミを使用して外側胸部と腹部を切開し、サンプルを冷蔵室で少なくとも24時間固定します。
次に、サンプルの識別、顕微鏡の倍率、画像の内容など、名前を付けて画像を保存するようにソフトウェアを設定します。手首と足首にサンプルを固定します。尾に向かって正中軸に沿って皮膚を切断する前に、鉗子を使用して首の中央の皮膚を持ち上げ、はさみで両方の脇の下に向かって皮膚を切ります。
次に、臍から脚まで皮膚を切ります。サンプルを埋め込んだ後、画面上のサンプルの中央にレーザー投影位置を調整し、ズームノブを20倍に調整します。分解能を最適化するには、ゲインを1, 250Vに設定します。
フォーカスノブを使用して青色の領域を最大化し、ゲインを約750Vにリセットしてイメージングします。次に、切断方法を自動に切り替えます。厚さを約50マイクロメートルに設定し、スライドを実行します。
肺と気道が見えたら切断を停止します。8〜10マイクロメートルの切断厚さを選択し、ライブビューを開きます。ミクロトームコミュニケーターを開いてイメージングを開始します。
画像を収集する前に、一時ストレージフォルダが空であることを確認してください。ハード構造が表示されていない場合は、イメージ収集を停止します。一時保存ファイルを1つのTIFF画像シリーズに出力します。
3D画像再構成の場合は、画像ファイルを画像処理ソフトウェアにドラッグアンドドロップします。ポップアップウィンドウが表示されたら、データベースにコピーするリンクまたはファイルを選択します。ファイルを開いたら、ツールバーの2D 3D再構築ツールメニューをクリックし、3D MPRを選択します。
ピクセルX解像度とピクセルY解像度の場合、ECMイメージング中に使用されるズームを指定して画像解像度を入力します。スライス間隔には、ECMイメージング中にカットに使用したスライスの厚さを入力します。次に、WWWLツールを使用して、ウィンドウの幅とウィンドウレベルを調整します。
画像上のツールをクリックして上方向にドラッグすると画像の明るさが下がり、下向きにドラッグすると画像の明るさが上がります。画像のツールをクリックして右にドラッグすると画像のコントラストが下がり、左の単語が増します。パンツールを使用して、画像を目的の位置にドラッグします。
ズームツールを使用して画像を拡大または縮小し、回転ツールを使用して必要に応じて画像を回転させます。次に、最初のパネルの色付きの軸をクリックしてドラッグします。この軸を回転させると、他の 2 つのパネルの向きがどのように変化するかに注目してください。
3つのパネルがサンプルのコロナ、矢状、および横方向のビューを表すまで、3つのパネル軸を回転させます。3つのパネルすべてを適切に配置、方向付け、明るくしたら、コロナビューを表すパネルをクリックします。次に、メニューバーの右側にある[ムービーのエクスポート]をクリックします。
バッチをクリックし、fromスライダーとtoスライダーをドラッグして、関心のある領域全体を囲みます。間隔については、厚さと同じオプションを選択し、ビューの向きを示すビデオを保存します。エコーは、ECMによって確認された正常なコントロールにおける脳室内シャントおよび正常に関連する大動脈のない無傷の心室中隔を示す。
正面図は、エコーとECMの両方でLA、RA、LV、およびRV間のコミュニケーションを示しており、房室中隔欠損を示唆しています。色の流れは、心室中隔欠損を示すLVとRVを横切る流れを示しています。エコーとECMは、LVとRVの間に心室中隔欠損を伴う右心室の二重出口を示し、大動脈が並んでいました。
持続性動脈切開症の超音波診断は、LVとRVの間の通信を示し、単一の流出路が両方の心室を上書きし、E14.5段階でECMによっても確認されました。ECM組織学から収集された切片は、免疫染色、ヘマトキシリンおよびエオジン染色、さらにはジェノタイピングおよび転写プロファイリングのための核酸抽出、またはプロテオミクス分析のためのタンパク質抽出のためにさらに処理することができます。3次元再構成からの画像は、面積や体積などの定量的境界の評価のためにさらに処理することができる。
先天性心疾患の病態メカニズムを解明するために、先天性心疾患の遺伝子操作および変異マウスモデルを確立するためには、心血管解剖学的構造の欠陥を特定するための正確な表現型が不可欠です。これは、先天性心疾患患者の臨床転帰を改善するための治療法と介入を開発する潜在的な機会につながる可能性があります。
