This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

試薬の調製<ol><li>集計バッファを準備し（20mMトリス、pH7.4中、100mMのNaCl、1mMのEDTA）。ヶ月間、室温で安定して保管してください。サプリメント1mMのは、使用前に（DTT）をジチオスレイトール。 NOTE：HEPESベースの緩衝液（10mM HEPES、pH7.5で、0.1mMのEDTA、5mMのDTT）もまた、タウ凝集に類似の結果を生成する。 </li><li> 0.22μmの無菌フィルターユニットによりチオフラビンTまたはチオフラビンS原液（凝集緩衝液に溶解3mMの、）、およびフィルタを準備します。ヶ月間、アルミホイルで安定したカバーチューブで-20℃で保存。 </li><li> （300μM、集計緩衝液に溶解）をヘパリン原液を準備します。 -20°Cで保存し、ヶ月間安定。 </li><li> （水に溶解し、1M、）ジチオスレイトール（DTT）の株式を準備します。 1.5ミリリットルチューブに小分けし。 -20℃で保管してください。凝集アッセイの前に、室温で1 M溶液を解凍する。この1,000倍在庫から、脱イオン水で100 mMの作業ストックの一定分量を準備。氷の上のままに直前まで。 </li><li> ℃の冷凍庫-80℃からタウを削除します。氷上で解凍します。集約緩衝液で所定濃度にタウを調整します。予め形成された大きな凝集体を除去し、4℃で10分間20800×gでマイクロ遠心スピン。このプレ紡糸工程は、タンパク質調製物の各バッチの後続の蛍光測定の一貫性を増大させる。別のチューブに上清を移し、凝集反応を組み立てるために準備ができるまで氷上に残す。 </li></ol> 2.無色素、ターミナルアッセイ注：このアッセイの凝集反応は、蛍光色素の不存在下で行われる。すべての成分を混合した後、反応物を所定の時間点まで進行させる。アリコートを凝集反応から取り出しのThTまたは蛍光読み取りの前に結合アミロイドTHSと混合される。凝集反応の初期体積は、必要とされる時点の数に依存する。このアプローチは、のrequありタウタンパク質を大量にIREが簡単で高速であり、蛍光光度計またはマルチウェルプレートリーダー（説明を参照）で行うことができる。以下は、蛍光定量化のためのISA SPEX FluoroMax-2コンパクトな分光蛍光光度計を使用して、ステップバイステップの操作です。 <ol><li> 表1のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、100μlの反応に必要な成分を表す。特定の実験のために必要な時点に基づいて、全体の集計ミックス量を調整します。ピペット操作エラーの余地を与えるために、各コンポーネントの追加の10パーセントを追加します。ここに示されている典型的な反応を含むヘパリンはアラキドン酸または集約バッファで置き換えることができる。反応混合物を1 mMのDTTを加える。全反応が1日以上続いた場合、還元環境を確保するために新鮮なDTT、毎日（1 mm）を補う。 </li><li>混合するチューブを数回転倒。プラ37℃のインキュベーターや水浴中CEの各反応。攪拌はタウ凝集のために必要とされていません。 </li><li>蛍光を測定する前に、（コンピュータその後、第1ランプ）分光蛍光をオンにします。 注：すぐに使用することができ、キセノンアークランプ。しかし、最良の結果を得るためにマシンが蛍光を読む前に約10分間のウォームアップすることができます。 </li><li>コンピュータ上のソフトウェアを起動します。 <ol><li> 510 nmの（5 nmのスリット）に計測器制御センターの実時間表示モード 、（2 nmのスリット）450nmの設定励起波長と発光波長を選択してください。閉じるリアルタイム表示モードウィンドウは計測器制御センターに戻ります。 </li><li> 一定の波長の分析を選択して、Enterキーを押して波長セットを追加するには、上部フレームで&gt;&gt;キーを追加します。 1〜3と最大トライアルへの標準誤差の集合取得パラメータ、[ 追加]をクリックします。 データ表示を開くために！GOをクリックします。窓。 </li><li> データ表示 ] ウィンドウで、 新しいサンプル]ダイアログボックスを開くには[スタート] ACQをクリックします。 サンプルタイプのために「不明」を選択します。 </li></ol></li><li>すべての100μlの集約混合物に、98μlの集計バッファとT.ピペットを数回混合する3 mMのチオフラビン2μlを添加する。 </li><li>キュベット（FCA3、外装寸法は、wxlxh = 12.5ミリメートルX 12.5ミリメートルX 45ミリメートル）の混合物全体を転送します。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。 </li><li>キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。 </li></ol>と色素3.をSpectraMax M2プレートリーダーで継続モードアッセイ注：このアッセイは、蛍光色素のThTまたはTHSがaggregaに含まれているという点で、以前のものとは異なるション反応。これは、反応の同じセットの連続測定を可能にする。なぜなら反応の反復使用のために、この方法は、より良好な自動マルチウェルプレートリーダー（スペクトラマックスM2の動作を次のように）で行われる。定期的な蛍光光度計も動作しますが、高速の集約反応の測定の頻度が原因の動作の説明書性質のため、多少制限されている。 <ol><li> 表2のように96ウェルプレート中で凝集ミックスを設定する（96ウェル黒色固体プレート、ウェル容量360μlを、平底）の各列は、一のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す時間点測定。数回ピペッティングしてよく混ぜる。実験の過程を通して、毎日新鮮な1mMのDTTを補足する。 </li><li> 37℃で96ウェルプレートをインキュベートする。 </li><li>蛍光測定の前に、各時点で、マルチモードマイクロプレートリーダー及びコンピュータの電源を入れる。 MAのための十分な時間を許可する背骨は、約10分間安定させる。 </li><li>コンピュータ上のソフトウェアを起動します。 37℃に温度を設定し、蛍光強度（FI-トップリード）モード、510 nmで450 nmおよび放出波長に設定励起波長を選択します。 </li><li>引き出しに96ウェルプレートを挿入し、測定を開始するために、READキーを押します。 </li><li>お読みになった後、プレートを取り外して、37℃のインキュベーターに戻し、それを返す。データ分析とプロットするためのExcelスプレッドシートにデータをコピーして貼り付け。 </li></ol> 4と染料、継続モードアッセイコンパクト分光蛍光光度計で<ol><li> 表3のように1.5mlのエッペンドルフチューブ中で凝集物を設定し、各列は、一時点の測定のために十分である、200μlの反応に必要な成分を表す。 </li><li>混合するチューブを数回転倒。 </li><li>分光蛍光光度計の電源を入れ、手順2.3と2.4のようにソフトウェアを設定する。 </li><li>混合物全体tを転送OAキュベット。サンプル·コンパートメント内の試料ホルダーにキュベットを置き、蓋を閉じます。蛍光データを収集するために実行]をクリックします。データを記録します。 </li><li> 実行]をクリックし、データを記録することにより、適切な間隔で読み続ける。凝集は、高周波数（ 例えば 、毎30または60秒）で監視する場合には、いずれかの測定が終了するまで機械キュベットおよび反応のまま、または反応またはキュベットを交換するのに十分な時間がある場合。 </li><li>キュベットを取り出し、その溶液をデカント。蒸留水により3回キュベットをすすぐ。キュベット内と外の空気を吹き付けることにより乾燥した。 </li></ol>

We have nothing to disclose.

このプロトコルは、リン酸化依存速いタウ凝集速度論を検出する別のアッセイ条件と楽器を示しています。端末アッセイでは、蛍光色素ThTを、各時点でのマスターミックスから除去された反応の一部に加えられる。アミロイド結合誘起蛍光次に26で測定される。第有する染料モードでは、タウ凝集は、タウ凝集体の成長のリアルタイム自動評価に適したこの種の反応をレンダリングの...

アルツハイマー病（AD）は、タウオパチーとして知られる神経変性疾患の大規模なコレクションの一つである。典型的な病理学の基礎となるタウオパチーは、ニューロン、アストロサイトとミクログリア1-4で神経原線維変化、NFTの、です。 NFT密度は、認知機能障害3,5及びニューロン損失6と相関する。 NFTはまっすぐまたは対らせんフィラメント（PHF）7,8を形成（以下、「P-タウ」とも呼ばれる）は、主に過剰リン酸化タウタンパク質が含まれています。タウは、ニューロンのシグナル伝達および輸送9,10に必須である軸索輸送を促進すると考えられ、微小管関連タンパク質である。各タウ分子は、正常な脳で2〜3リン酸を含むが、タウオパチー患者11内の複数の折り目によってホスホリル含有量が増加する。複数のキナーゼは、GSK3β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β）及びCDK5（サイクリン·ドなどのタウの過剰リン酸化に貢献する可能性があるペンダントキナーゼ5）12,13が、病理学的リン酸化のための直接の引き金は、とらえどころのない14のまま。微小管結合モチーフまたは周辺の異常なリン酸化は、微小管15からタウを解離し、p-タウは、最終的にNFT介在物に重合させることができる直鎖または対らせんフィラメントにオリゴマー化する細胞体コンパートメントにタウ誤局在を引き起こす。タウの過剰リン酸化、NFT形成、及び神経変性の間の緊密な提携は、p-タウのもつれがアポトーシスおよび他の細胞毒性反応を誘発するため、タウオパチーの神経変性16,17のための根本的な原因であることが流行しているという仮説につながった。この前提に基づく薬物スクリーニングと初期の臨床試験は、18を立ち上げてきた。しかし、この仮説は19,20挑戦に直面している。例えば、サンタクルスらは、トランスジェニックマウスの認知機能は、変異体の発現を抑制することにより改善することができることを示したのNFTは、既存のタウ分子21から形成するために続けていても、人間のタウ、。 ショウジョウバエモデルでは、NFTは、基礎となる神経細胞22,23を保護するために有毒な細胞質ゾルタウを隔離することが示された。明らかに、NFTの病因の役割は、もしあれば、大いにタウオパチー治療薬の開発の方向性に影響を与えます。 いくつかのβシート好ましい蛍光色素、電子顕微鏡法、光散乱分光法24-27の結合によって示されるように、高濃度では、組換えまたは正常な脳のタウタンパク質は自然に、ゆっくり、 インビトロでの PHF様構造へと重合する。追加ヘパリンまたはアラキドン酸、人間の脳に豊富脂肪酸は、大幅にタウisoform-と誘導物質の濃度依存マナー28-32でPHFの形成を促進する。興味深いことに、過リン酸化タウは、AD脳から精製またはインビトロリン酸化反応A に網羅して調製より速くggregatesと、より効率的に26,33-35。これらの結果は、p-タウの病理学的役割とよく一致している。 p-タウの凝集に基づくインビトロシステムは、このようにADの薬物スクリーニングのための強力なツールとして機能することができる。 タウ凝集およびADの進行神経変性、ならびにAβ斑をターゲットに医薬品開発の最近の失敗、AD 36-38のもう一つの重要な組織学的マーカーの間に密接な関連性を考えると、タウ凝集を制御する薬を発見するの関心が高まっている。実際、いくつかのグループがすでに一次アッセイとして体外タウ凝集反応に使用して、異なるスループットで薬物スクリーニングを開始しました。多くの化学物質は、 インビトロ 39-42 でタウ凝集阻害または逆転活性を示すことが見出された。しかし、現在のすべてのタウ凝集レギュレータスクリーンは蛍光体の主要な病理学的なマークをミス修正されていないタウを使用ylation、ADの治療におけるこれらの化合物を使用しての特異性および有効性の懸念を高める。 生化学的特性およびADの薬物スクリーニングのための凝集アッセイの開発の大きな障害の一つは、病態生理学的に関連した高リン酸化タウタンパク質の十分な量の産生である。タウの1N4RアイソフォームとGSK-3βキナーゼはEに共発現されているジッパーアシスト触媒反応システムを用いて、 大腸菌は、ロイシンジッパー融合タンパク質として、私たちは、この課題を克服している（。隋ら 、提出され、タウとp-タウの最終製品については、図1を参照してください。また、p-タウの予備質量分析の特性評価のための43を参照）。タウの異なるリン酸化部位に特異的な9抗体のパネルから、陽性シグナルは、8つの位置で見られた（データは示さず）。以下では、集約運動Dを区別できるプロトコルおよびインストルメンテーションを記述する変更されていないタウとpタウ種間ifferences。これらのアッセイは、26アミロイド結合の際に、チオフラビンT（THT）またはチオフラビンS（THS）の蛍光の増加（タウ凝集体）を測定した公開されたプロトコルから変更された。最初の「端末」は、無色素のアプローチは、凝集反応が組み立てられ、アミロイド色素の非存在下でインキュベートした。異なる時点で、各反応のアリコートを除去し、タウ凝集体を結合するためのThTの凝集を停止し、可能にするためのThT含有緩衝液の等量。蛍光は、IAP FluoroMax-2蛍光光度計で測定される。第二」の色素「継続的なモニタリングアッセイでは、ThTのまたはTHSは凝集反応に含まれる。蛍光は、手動で、実験全体を通じて連続的に測定またはマルチプレートリーダーを使用することができる。加えて、我々は継続的な測定MOにおける集計のためのタウおよびp-タウの近生理的濃度を使用するアッセイを説明デ。リン酸化の効果は容易に検出可能のままである。以下では、ステップバイステップの操作手順を説明し、これらのアッセイの代表的な結果が表示されます。各アプローチの長所と短所のいくつかの議論だけでなく、潜在的な薬剤スクリーニングアプリケーションが続きます。 高濃度では、タウは自然にアミロイド様構造へと集約されます。しかし、実験室で、タウ線維化は、典型的には、ヘパリン（平均分子量6,000グラム/モル）及びアラキドン酸のような誘導因子によって促進される。ここに示した例には、30μMのヘパリンが含まれています。タウアミロイド凝集体の形成を、チオフラビンT（ThTの）またはチオフラビンS（THS）のアミロイド結合性から生じる蛍光によりモニターされる。 （;：485 nmの発光ピークを450nm励起）タウ凝集体に結合すると、ThTの蛍光の赤いシフトを示す。 THSは、一方では、アミロイドは結合の前に510ナノメートル（450nmで励起）で弱い発光を有するが、このfluorescenc電子は、このような凝集したタウ44とアミロイドタンパク質の存在下で有意に増加する。両方の色素は、タウおよびp-タウ凝集を検出するのに適しています。ためのThTの強力かつ比較的広い発光ピーク（ 図2参照）から、510 nmでの蛍光単位でわずか30％の減少がある。いずれかの染料を使用する際の便宜のために、我々は、タウ凝集をモニターするために、励起/発光波長（ すなわち 、450nmの/ 510 nm）の同じ組み合わせを使用する。 タウ凝集は、アッセイの目的とタウタンパク質の可用性に応じて、染料の存在下または非存在下で行うことができる。反応の両方のモードを以下に示します。単一のサンプル蛍光光度計（ISA-SPEX FluoroMax-2）と、マルチプレートリーダー（スペクトラマックスM2） - 加えて、我々は2つ​​の異なる機器の動作を実証する。読者は彼らの特定のニーズや機器の可用性に合わせて、これらのプロトコルを適応させることができるはずです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

組換えtauおよびp-タウ（ 図1）を使用して、我々は、タウを含む、タンパク質凝集体をアミロイドへの結合の際のThTとTHSの強い蛍光発光を利用して、タウの凝集およびp-タウの動態を比較するために2つの異なるプロトコルを設立及びp-タウ（ 図2）。凝集反応における蛍光色素の有無にかかわらず、我々は過剰リン酸化（ 図3-5）でタウ凝集の一貫した強化?...

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.3K ビュー.  Michigan State University. 非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...