この時間を節約する方法は、解剖学および局所的なタンパク質および組織の可視化を最適化するために、神経科学研究における免疫組織化学的手順のラウンド間の変動を減少させる。この技術の主な利点は、複数の脳を単一の凍結ブロックに組み合わせることで、凍結切断と脳組織の取り付けにかかる時間を短縮することです。この技術はげっ歯類の脳の冠状動脈セクションに最適化されていますが、矢状または横方向のセクション、または筋肉や肝臓などの異なるタイプの組織に適応することができます。
正常な経心面灌流に続いて、24時間PBSで4%パラホルムアルデヒドの25ミリリットルバイアルで動物からの脳を後固定する。この後、パラホルムアルデヒドから脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。TBSで30%スクロース溶液の約20ミリリットルのバイアルに脳を移す。
彼らはバイアルの底に沈むまで、脳と解決策を保ちます.次に、アイスバケツのドライアイスのベッドの上に500ミリリットルのガラスビーカーを置きます。その後、ビーカーに300〜400ミリリットルのイポペンタンを注ぎます。
マイナス45度とマイナス50°Cの間のイセペンタンを維持します。ベンチ上部で、最適な切断温度またはOCT化合物で、使い捨て埋め込み金型をほぼ半分いっぱいに充填します。針を使用して、金型から気泡を取り除きます。
スクロース溶液から最初の脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。その後、半球を分離する前に小脳と嗅球を取り除くために新しいカミソリの刃を使用してください。次に、脳に数値命名システムを与えます。
鈍い鉗子を使用し、2番目の位置に置かれる脳を拾い、最初に上向きに切り取られる側でそれを向ける。OCTに脳を下げ、ピンセットを使用して独立して立つまで位置を調整します。この手法の重要な変更は、位置 1 の空白です。
この空間は、メガブレインの向きを容易に識別できるように指定されているため、各脳に関連付けられている動物を識別します。すべての脳が金型に配置された後、脳の上部をカバーするのに十分なOCTを追加し、針を使用して気泡を取り除きます。フォースプを使用して金型のコーナーを保持し、フォースが OCT で部分的に水没しないようにします。
次に、金型の底部3分の1が水没するように、イソペンタンにモールドを下げます。30秒後、金型全体をイポペンタンに下げ、鉗子から放出します。3分後、鉗子を使用してイポランタンから金型を取り除きます。
金型とその内容物を直ちにアルミホイルで包み、適切なラベルを貼ります。メガブレインを最低24時間、マイナス20°Cの冷凍庫に移します。まず、クライオスタットキャビネットの温度をマイナス19°Cに設定します。
冷凍庫からメガブレインを取り出し、クライオスタットに入れる。その後、チャックと2つの薄い先端のペイントブラシをクライオスタットに置きます。この後、メガブレイン識別番号とスライド番号でスライドにラベルを付け、スライドウォーマーにスライドを置きます。
次に、メガブレインを解き放ち、カミソリの刃を使用してカビの角をカットします。OCTの薄い層をチャックに分配します。その後、すぐにチャックの上にメガブレインを置きます。
OCTが完全に凍結した後、メガブレインの側面の周りにOCTの2ミリメートル層を適用し、チャックに側面を実行することができます。カミソリの刃を使用して、チャックの側面と底部から余分なOCTを取り除きます。まず、クライオスタットのチャックヘッドにメガブレインを搭載したチャックを配置します。
次に、クライオスタットを希望の厚さに設定します。組織の収集のために所望の脳領域に到達するために必要に応じてOCTと組織をトリミング.その後、ステージ上に置かれるまでアンチロールプレートを下げ、クライオスタットハンドルを回して単一のセクションを取ります。
反ロールプレートをゆっくりと持ち上げ、組織部分が触れないように注意してください。塗料ブラシをそっと使って、平らに横たわるまで組織セクションを展開します。必要に応じて、ペイントブラシを使用してOCTフラットを保持し、ローリングを防ぎます。
次に、スライドウォーマーからスライドを取り外し、スライドラベルをメガブレインセクションの上に下に置き、スライドに固執できるようにします。迅速に組織のセクションにPBSの滴を適用します。PBSに浸した細かい先端のペイントブラシを使用して、組織セクション内の気泡を磨き、スライド上に平らに横たわっているように組織を展開します。
最後に、スライドウォーマーの上にスライドを置いて45分間乾燥させ、マイナス80°Cでスライドを保存します。このプロトコルでは、9匹の動物からの脳組織を準備し、同時に凍結切断した。凍結切除後、H&E染色を行い、凍結保護の品質を評価することができます。
イオン化カルシウム結合アダプター分子1またはIba1ミクログリアの染色の代表的な結果は、各研究脳間の一貫した染色を単一のメガブレイン上で示す。この手順を試みる間、異常な組織の完全性につながる組織の割れや解凍を防ぐために、メガブレインを凍結しながら常に温度を監視することを忘れないでください。これは、染色中にグループ間の差異を作成し、イメージングと分析中にバイアスと主観性を減らすことができるので、別々のメガブレインで異なる治療群を分離することはお勧めしません。
パラホルムアルデヒドを使用することは非常に危険であり、PBEを着用し、フードで作業するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
