アイソメトリックまたはテンソメトリックミオグラフィーを、適切に制御された生理学的条件で小さな抵抗または大きな導管血管の反応性を測定するためのゴールドスタンダードプロトコルとして実証します。測定は再現性と信頼性が高いです。この技術は、研究者が血管の異なる層を個別に研究したり、血管壁の異なる層間の相互作用を同時に調査したりすることを可能にする上で非常に貴重です。
手順を実演するのは、私の研究室の研究室スペシャリストであるロバートフォークです。まず、ウォーターバスをオンにして摂氏37度に設定します。適切にラベル付けされた2つのビーカーを水浴に入れ、1つは600ミリリットルのHEPES-PSS溶液、もう1つは150ミリリットルの高カリウム溶液を入れます。
300ミリリットルのHEPES-PSS溶液を含むビーカーをカルボゲンガスで少なくとも10分間通気します。通気したHEPES-PSS溶液30ミリリットルを50ミリリットルの遠沈管に加え、適切にラベルを付けて氷上に置きます。残りの通気HEPES-PSS溶液を氷上に保ち、大動脈解離プロセス中に使用します。
各筋鏡室に5ミリリットルのHEPES-PSS溶液で4室筋電視装置の電源を入れ、熱を摂氏37度に設定します。各チャンバー内の溶液を30分間通気し、チャンバーが希望の摂氏37度に達したことを確認します。ミオグラフデータ収集ハードウェアとコンピューターの電源を入れます。
安楽死させたマウスから切除した胸郭を、氷冷曝気HEPES-PSSバッファーで満たされた透明なシリコーンエラストマーコーティングされたペトリ皿に移し、両側に固定します。顕微鏡下で、心臓と付着した大動脈を胸郭からそっと切断して取り外し、清潔なシリコーンエラストマーでコーティングされた皿に移し、次に大動脈から脂肪結合組織と凝固した血液をそっと取り除きます。鋭利な小さなハサミを使用して、アーチ領域から下行大動脈の底まで大動脈全体を解剖して分離します。
解剖した大動脈をそれぞれ2ミリメートルの4つのセグメントに切断します。皿の中のミニ定規を参考にしてください。すでに5ミリリットルの加温および通気HEPES-PSSバッファーが入っているチャンバーで、鉗子を使用して2ミリメートルの大動脈セグメントのそれぞれを2つの取り付けピンに慎重にスライドさせます。
チャンバーを筋電視ユニットに戻すときは、マイクロメータを反時計回りに回転させてピンをゆっくりと離し、大動脈セグメントがピンから滑り落ちないようにします。各筋鏡チャンバーをユニットに戻し、チャンバーを摂氏37度で20分間通気し始めます。チャンバーを排水し、5ミリリットルの新鮮で温かい通気HEPES-PSS溶液を各チャンバーに追加します。
必要に応じて、力の測定値を再調整して、6ミリニュートンの最適な張力を読み取ります。さらに15〜20分間組織を休ませます。データ集録ソフトウェアを開きます。
追跡番号を50から1、500から1に変更し、[開始]を押します。新しい実験を開始する前に、データ集録ソフトウェアに適切なラベルを追加してください。各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を加える前に、チャンバーをもう一度排水します。
高カリウム溶液に対する収縮反応が力発生のプラトーに達したらすぐにチャンバーを再び排出します。HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を追加します。
高カリウム溶液に対する収縮反応が力発生のプラトーに達したらすぐにチャンバーを排水し、HEPES-PSSで組織を3回洗浄してから、組織を15〜20分間静かにします。大動脈セグメントを血管収縮剤PEと最大用量以下の用量で事前に契約する。PE誘発収縮曲線が張力発達のプラトーに達するのを待ちます。
テキスト原稿に記載されているように、ミオグラフチャンバー内のアセチルコリンの最終濃度を50ピコモルから10マイクロモルに確立するために、3分間隔でアセチルコリンワーキングストック溶液の5マイクロリットルの増加用量でPEに張力発達のプラトーを追加します。用量反応実験が完了したら、チャンバーを排出し、大動脈セグメントを温かく通気したHEPES-PSS溶液で3回洗浄し、組織を30分間休ませます。大動脈セグメントを30分間休ませた後、チャンバーを排出し、新鮮で温かい高カリウム溶液を各チャンバーに追加し、チャンバーを排出し、高カリウム溶液に対する収縮反応がFプラトーに達したらHEPES-PSS溶液で組織を洗浄します前述のように。
10マイクロリットルの調製した100ミリモルのワーキングストック溶液を加えて大動脈セグメントをL-NAMEでプレインキュベートし、観察されたアセチルコリン誘発血管弛緩に対する一酸化窒素産生の寄与を評価します。L名を削除せずに、大動脈収縮を誘発するためにチャンバーにPEの最大用量以下を追加します。PE誘発収縮曲線が緊張発達のプラトーに達するまで待ってから、アセチルコリンをミオグラフチャンバーに追加して、最終濃度500ナノモルを達成します。
形成されたプラトーが安定するまで、力の発達に起こりうる変化を記録するために数分待ちます。チャンバーを排水し、温かい通気HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。顕微鏡の下に筋鏡室を配置し、大動脈の内腔に小さなワイヤーをそっと通します。
ワイヤーをルーメンに短時間通します。大動脈を2ミリメートルの大動脈リングに切断し、それらのリングを筋電図室に取り付けます。最適な張力を6ミリニュートンに設定し、組織を通気された温かいHEPES-PSSバッファーで30分間休ませてから、チャンバーを排水し、5ミリリットルの新鮮な温かい通気HEPES-PSS溶液を各チャンバーに追加します。
すべてのミオグラフチャンバーの力をゼロにし、マイクロメータを反時計回りにゆっくりと回転させて、登録された力がマウス大動脈に必要な最適な張力に達するまでピン間の距離を広げます。最適な張力でさらに15〜20分間組織を押してから、チャンバーをもう一度排出してから、各チャンバーに5ミリリットルの高カリウム溶液を追加します。チャンバーを再度排出し、高カリウムイオン溶液に対する収縮反応がプラトーに達したら、HEPES-PSS溶液で組織を3回洗浄します。
組織を15〜20分間休ませてから、血管収縮剤であるPEで大動脈セグメントを事前に収縮させます。PE誘発力がプラトーに達したら、アセチルコリンのサブ最大濃度を筋鏡室に追加して、最終濃度500ナノモルを達成します。実験を終了する前に、PE誘発力発生の登録プラトーが変化していないことを確認するために3分間待ちます。
各単離された血管の完全性および生存率は、収縮力の発生を記録することによって評価された。記録された力のピークは、後に、アゴニストに応答して同じセグメントに対する力の発生を正規化するために使用された。内皮を介した血管弛緩測定は、平滑筋を介した収縮と力の発生を示しました。
PE誘発収縮がプラトーに達すると、アセチルコリンの用量を増やすと、孤立したセグメントで最大の血管弛緩が達成されました。.一酸化窒素阻害剤L-NAMEは、収縮前の大動脈におけるアセチルコリン誘発血管弛緩を完全にブロックし、アセチルコリンが一酸化窒素産生の増加を通じて大動脈血管弛緩を誘導することを示しています。さらに、大動脈セグメントから内皮層を除去すると、アセチルコリン誘発血管弛緩もブロックされ、血管弛緩における内皮の役割が強調されました。
血管の取り扱い、洗浄、解剖中は、穏やかであるようにしてください。薬理学的アゴニストおよび阻害剤は、筋鏡室に取り付けられた血管リングを乱さないように注意して添加することが重要です。この情報は、特定の血管層の機能不全に対処するための潜在的な治療アプローチを探求するための実験を設計するのに役立ちます。
