ここでは、蛍光標識RNAのマイクロインジェクションを適用して、カハル体と呼ばれる核構造への短核RNAの局在化に不可欠なRNA配列を検出しました。この手法には、2 つの大きな利点があります。まず、ラベルや追跡が難しい短いRNAに適用できます。
第二に、異なる配列の迅速なスクリーニングを可能にし、RNAの局在におけるそれらの役割をテストする。マイクロインジェクションの1日前に、12ミリメートルのカバーリップ上のHeLaまたは他の付着細胞を播種し、マイクロインジェクション時に50%の合流度に達する。まず、準備したカバースリップをペトリ皿の中央に入れ、細胞と2ミリメートルの培養培地を加えます。
翌日、細胞充填されたペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。マイクロローダーを使用して、snRNA混合物の3マイクロリットルを針にロードし、ペトリ皿の表面に対して45度の角度でマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。針を見つけるために10倍の長距離目的を使用してください。
まず、注射器に粗い速度を設定し、それが培養培地に触れるまで針を下げる。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つける。針の先端が観察されるまで、顕微鏡を見ながら速度を細かくし、さらに針を下げます。
視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。その後、セルを選択し、針をセルの上に移動します。セル接触の圧力と時間を設定します。
針を細胞の中に下に移動し、マイクロマニピュレーターの下限を設定します。プロトコルの最も重要な部分は、下限を設定します。カバースリップサーフェスは完璧ではなく、各セルが異なるため、注入セッション中に何度か下限を設定する必要があります。
次に、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックの注射ボタンを押します。針は、RNA混合物を注入するために限界が設定されている場所に細胞の中で自動的に移動します。完了するには、インジェクタのメニューボタンを押し、ホルダーから針を取り外します。
次に、インジェクタとマイクロマニピュレーターの電源を切る前に、チューブをインジェクタから取り外します。マイクロインジェクション後、細胞を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、室温でPBSで細胞を3回リンスする。
pH 6.9で0.1モルパイプに4%パラホルムアルデヒドで20分間細胞を固定します。その後、室温PBSで細胞を3回洗浄します。snRNAの局在のみを分析する場合は、水中の細胞を短時間リンスし、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。
タンパク質の局在化を追加する場合は、PBSで0.5%トリトンX-100で細胞を室温で5分間透過させます。細胞をPBSで3回リンスし、テキストプロトコルで概説されているように適切な一次および二次抗体でそれらを染色します。その後、PBSで3回すすいで、水に1回リンスします。
その後、DAPIを使用して、セルを取り付け媒体に取り付けます。画像を撮影する準備ができたら、浸漬目的を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。マイクロインジェクションされた細胞が同定されたら、サンプル当たり200ナノメートルZステップで20Zセクションのスタックを収集し、数学的なデコンボリューションを受けます。
蛍光信号を定量化するには、まず ImageJ で顕微鏡画像を開き、チャンネルをウィンドウに分割します。同期ウィンドウ ツールでウィンドウを同期します。次に、コイリン免疫染色によって同定されたカハル体の周囲に関心領域を描く。
コイリン定義ROIにおけるsnRNAシグナルの強度を測定します。核内に無作為に配置されたROI中のsnRNA蛍光の強度を決定する。測定値を保存し、カハル体と核内のRNAシグナルの比率を計算します。
本研究では、蛍光標識されたsnRNAをマイクロインジェクションして細胞内の輸送を監視する。SM部位がカハル体蓄積にとって重要であるかどうかを検査するために、SM部位を欠いているsnRNAは核に直接マイクロインジェクションされる。細胞質への注入はコントロールとして機能し、一方で全長snRNAは、陽性対照として機能するようにマイクロインジェクションされる。
インキュベーション後、マイクロインジェクションされた細胞は固定され、カハル体マーカーコイリンは間接的な免疫蛍光によって可視化される。全長snRNAは、核および細胞質注射の両方後にカハル体に蓄積された。対照的に、SM部位を欠いたsnRNAは、このコンパートメントへのマイクロインジェクション後に細胞質に残り、SM部位を除くsnRNAは、このsnRNAが核内に残っているがカジャール体に蓄積しないため、SM結合配列がカジャール体の局在化にとって重要であることを明らかにした。
時には、1つの細胞コンパートメントへのマイクロインジェクションだけが失敗し、Dextran 70キロダルトンは核と細胞質の両方で見つけることができます。これらのセルは、さらなる分析から廃棄されます。蛍光標識されたsnRNAは、注射前に80°Cの負の80度で保存されているにもかかわらず、RNAの分解が起こり得る。
細胞質に注入された分解されたsnRNAは核に輸送されず、細胞質に局在し続ける。そのようなsnRNAは廃棄されるべきであり、新しいsnRNAは合成されるべきである。細胞タイプの注入と補償圧力を正しく調整することが重要です。
そして、前に述べたように、細胞注入のための正しい下限を設定することは、良好なマイクロインジェクションに不可欠です。RNAの単離中に使用されるフェノールクロロホルムは危険であり、マイクロインジェクションニードルは鋭利な物体であることを覚えておいてください。これらの材料を取り扱う際は注意してください。
