この研究は、脳虚血の回復と後遺症の段階を研究するために確立された動物モデルを使用しています。この技術の主な利点は、安定した信頼性が高く、比較的簡単であることです。手術用固定テーブルに麻酔をかけたラットを置くことから始めます。
手術を通して、小さい動物のサーモスタットでラットの体温を摂氏37度に保つ。口を麻酔機のマスクに接続し、四肢の緊張、角膜反射および痛みの欠如によって深い麻酔を確認する。紙包帯を使用して、ラットの手足を手術台に固定します。
電気剃毛で、ネックコートを取り外し、75%アルコールで首を殺菌します。眼科用はさみを使用して、首の中央縦方向の形状に沿って2〜3センチメートルをカットします。そして、眼球鉗子で、皮下筋を分離する。
完全に視野を公開するために自家製のリトラクターを使用してください。すべての生存外科手術に適切な無菌技術を提示するために注意が必要です。ビデオの後半で説明するテクニックは、手順全体を通して実践する必要があります。
マイクロ鉗子を使用して、一般的な頸動脈、外的頸動脈および内頸動脈を分離する。顕微鏡で作業し、8-0を使用硬い結び目で一般的な頸動脈をリゲートする縫合糸、硬い結び目で心臓端から遠く離れた外部頸動脈、緩い結び目を持つ内部頸動脈、そして心臓端付近の外頸動脈を並べるようにする。マイクロハサミを使用して、外頸動脈の小さな開口部を切断し、そっと糸ボルトを挿入します。
細く、ゆるい結び目である外頸動脈の縫合をリゲートし、外頸動脈を切断する。内部頸動脈のゆるい結び目を緩め、縫合糸でマークされた中大脳動脈の始めに糸ボルトを挿入し続け、露出した糸ボルトを切断します。2~3時間後に虚血時間に達した後、マイクロ鉗子を用いて外頸動脈の骨折を修正し、別のマイクロ鉗子で糸ボルトをそっと引き抜く。
ねじボルトの前端を内側頸動脈から完全に引き出した後、8-0で並んでいる外的頸動脈をリゲートする縫合し、糸ボルトを完全に取り外します。一般的な頸動脈を緩めた後、約50,000単位のペニシリンナトリウム粉末を創傷表面にアブし、感染を防ぐ。皮下筋と皮膚を縫合するために4つの縫合糸を使用してください。
ラットをケージに戻した後、1ミリリットルの注射器を使用して、術後脱水を防ぐためにラットに約0.2ミリリットルの水を経口で与えます。TTC染色または感覚運動研究のための最長スコアに従って動物を選択してください。TTC染色用に分離した脳を30分のマイナス20度でインキュベートした後、あらかじめ冷却されたラットの脳スライス型に入れます。
事前に冷却されたブレードを使用して、脳を6つの2ミリメートルの厚さの連続したセクションに切断します。6ウェル培養プレートに2%TTCのセクションを染色し、振りながら摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。10分ごとに、脳虚血と影響を受けない領域が目に見えて白と赤になるまでセクションを反転させます。
各行の全長が同じであることを確認し、写真を撮るために定規を使用して、脳の背面から脳の前部に順番に脳のスライスを黒段ボールに垂直に並べ替えます。写真をインポートし、脳のスライスを選択します。黒の前景を選択し、Alt Delete と入力して背景色を塗りつぶし、コントロール D を選択解除します。
最後に、イメージをデスクトップに保存します。梗塞の容積を分析するには、まずソフトウェアを開いて写真をインポートします。欠陥修正するには、背景が黒になるようにコントラスト強調ツールで明るさを調整します。
フィルターで、中央値ツールを使用してハイライトを削除します。左正常脳領域を計算するには、セグメンテーションを使用して色を選択し、H、S、Iの値を調整して脳のスライスを黒い背景から分離します。カウントサイズに戻り、カウントをクリックします。
編集中の分割オブジェクトをクリックすると、脳と中線が分離され、左右の脳領域が自動的に区別されます。右梗塞脳領域を計算するには、画像をインポートし、背景を調整し、以前に行ったようにハイライトを削除します。カウントサイズを選択し、編集中にマージオブジェクトを描画ツールをクリックします。
手動で虚血領域を選択し、虚血領域を計算するためにカウントをクリックします。適切な健康な脳領域を計算するには、まず画像を読み込み、背景を調整し、前に行ったハイライトを削除します。セグメンテーションを使用して色を選択し、H、S、Iの値を調整して、健康な脳スライスを黒い背景から分離します。
カウントサイズに戻り、カウントをクリックしてこの領域を計算します。編集中の分割オブジェクトをクリックすると、脳と中線が分離され、左右の脳領域が自動的に区別されます。感覚運動研究と両側のアサイメトリー試験のために選ばれたラットを取り、等しい圧力を使用して各フォア爪の伏せ目部分に紙テープを3回包みます。
各ラットについて、各前爪が接触する回数をカメラで記録し、影響を受けない足の時間を含む5分以内にテープを取り外します。30 分後にラッピングと記録を繰り返し、値を計算します。グリッドウォーキングテストでは、ラットを2.5平方センチメートルの開口部を持つ高架グリッド表面プラットフォームの中央に配置します。
ラットの腰を少し押して、表面を横切って移動するように促します。カメラを使用して、影響を受けない右手足と左の影響を受けない手足によって行われた足の欠陥の数と、カメラで1分間の合計ステップ数を記録します。ローターロッド試験では、支持ソフトウェアを使用して5分間で13RPMの速度にラット回転バー疲労装置を設置します。
コンピュータプログラムを起動し、同時にロータロッドリングにラットを置きます。ラットがリングから落ちた場合、または5分後に試験を終了し、回転時間を記録します。ラットを30分間放置し、テストをさらに2回繰り返し、最後の回転時間として最大値を選択します。
ロープ試験を持ち上げるには、持ち上がるロープの器具を机の上に置いてください。ラットに前肢でロープをつかみ、吊り下げさせなさい。ぶら下がった時間を記録し、スコアを計算します。
中大脳動脈閉塞と再灌流によって誘発された脳虚血性傷害を研究した場合、300グラムの体重3040糸ボルトと3時間の脳梗塞時間が最も大きい脳梗塞、最も長いスコア、最大のモデル成功率に最も適していることが判明した。これは、275グラムの重量、2636糸ボルトおよび2時間の脳梗塞時間の従来の処置と比較して有意に改善された。脳虚血の回復状態を調べ、TTC染色を行い、中大脳動脈閉塞と再灌流の初日に梗塞と収縮量を23.4%、35日目に19.6%、60日目に16.1%、90日に15.7%で縮小を明らかにした。
中大脳動脈閉塞と再灌流の1日後、両側のアサイメトリー試験における感覚運動バイアス、グリッドウォーキングテストにおけるグリッドウォーキングエラー時間、リフティングロープテストにおけるリフティングロープスコアはすべて増加し、ローターロッド試験におけるローターロッド時間は急性脳虚血の研究におけるこれらの試験の重要性を示す減少した。感覚運動バイアスだけが、中脳動脈閉塞および再灌流の35、60および90日後に時間依存的な方法で大きな機能障害を維持した。グリッドウォーキングテストでは、35日と60日間のグリッドウォーキングエラー時間の有意な違いがありました。
これらの結果は、これら2つの試験がラットの回復をテストするのに適している可能性があることを示した。成功を確実にするためには、アクションは穏やかで、操作は安定している必要があります。歩行検出などの他の行動テストもこのモデルに適している可能性があります。
このモデルの開発は、研究者が回復および後遺症の段階で脳虚血を探求する道を開く可能性がある。
