本研究使用既定的动物模型来研究脑缺血的恢复和后遗症阶段。该技术的主要优点是稳定、可靠、相对简单。首先将麻醉大鼠放在手术固定台上。
在整个手术过程中,在小型动物恒温器中将大鼠的体温保持在37摄氏度。将口腔连接到麻醉机面罩,并确认缺乏四肢张力、角膜反射和疼痛的深度麻醉。用纸绷带将大鼠的四肢固定到手术台上。
使用电动剃须刀,取下颈部涂层,用 75% 酒精对颈部进行消毒。使用眼科剪刀沿颈部的中央纵向形状切割两到三厘米。然后用眼皮钳分离皮下肌肉。
使用自制的缩回器完全暴露视野。必须注意为所有生存外科手术提供适当的无菌技术。稍后在视频中演示的技术应在整个过程中练习。
使用微钳分离常见的胡萝卜动脉、外胡萝卜动脉和内胡萝卜动脉。在显微镜下工作,使用 8-0缝合用硬结将常见的胡萝卜动脉、远离心端的胡萝卜动脉用硬结、内冠状动脉用松结,然后将外胡萝卜动脉用硬结线。使用微型剪刀,在外部胡萝卜动脉中切割一个小开口,然后轻轻插入螺纹螺栓。
缝合细松结的外胡萝卜动脉的缝合,切断外皮状动脉。松开内胡萝卜动脉的松动结,继续将螺纹螺栓插入标有缝合的中脑动脉的开始,并切断暴露的螺纹螺栓。缺血时间达到两到三个小时后,使用微钳固定外胡萝卜动脉断裂,用另一个微钳轻轻拉出螺纹螺栓。
从内部胡萝卜动脉完全将螺纹螺栓的前端从内胡萝卜动脉中退出后,将已衬上 8-0 的外部胡萝卜动脉拉开缝合,然后完全拆下螺纹螺栓。松开常见的胡萝卜动脉后,在伤口表面涂抹约5万单位的青霉素钠粉,以防止感染。使用四种缝合缝合皮下肌肉和皮肤。
将大鼠放回笼子后,使用一毫升注射器向大鼠口头提供约 0.2 毫升的水,以防止术后脱水。根据 TTC 染色或感觉运动研究的最长分数选择动物。在30分钟零下20摄氏度的零下20摄氏度下分离出分离的TTC染色大脑后,将它放在预冷的老鼠脑切片模具中。
使用预冷刀片,将大脑切成六个两毫米厚的连续部分。在六井培养板中用 2%TTC 染色部分,并在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟,同时摇动。每10分钟,翻转部分,直到大脑缺血和未受影响的区域明显是白色和红色。
用尺子将大脑切片垂直排列在黑色纸板上,从背面到大脑前部,以确保每行的总长度相同并拍照。导入照片并选择大脑切片。选择黑色前景并键入 Alt 删除以填充背景颜色,然后控制 D 取消选择。
最后,将映像保存到桌面。要分析梗塞卷,请先打开软件并导入照片。要缺陷修改,请使用对比度增强工具调整亮度,使背景为黑色。
在过滤器中,使用中位数工具删除高光。要计算左正常大脑区域,请使用分割选择颜色,并调整 H、S 和 I 的值,以将大脑切片与黑色背景分开。返回到计数大小并单击计数。
单击编辑中的拆分对象,将大脑与中线分开,中线会自动区分左右脑区域。要计算右梗脑区域,请导入图像,调整背景,并删除以前所做的高光。选择计数大小并在编辑中单击绘制合并对象工具。
手动选择缺血区域并单击计数以计算缺血区域。要计算正确的健康大脑区域,请先导入图像,调整背景,然后删除以前所做的高光。使用分割选择颜色并调整 H、S 和 I 的值,以将健康的大脑切片与黑色背景分开。
返回计数大小并单击计数以计算此区域。单击编辑中的拆分对象,将大脑与中线分开,中线会自动区分左右脑区域。以选择用于感官运动研究以及双边测数测试的老鼠,用相等的压力将纸胶带包在每个前爪的下垂部分三次。
对于每只老鼠,用相机记录每个前爪接触的时间,并在五分钟内取出磁带,包括未受影响的和受影响的爪子时间。30 分钟后重复包装和记录,然后计算值。对于网格行走测试,将大鼠放在具有 2.5 平方厘米开口的高架网格表面平台的中心。
稍微推老鼠的臀部,鼓励它穿过表面。使用相机,使用摄像机在一分钟内记录右侧未受影响的左脚故障数和左侧受影响的四肢和总步数。对于转子棒测试,使用支持软件将大鼠旋转杆疲劳装置设置为 13 RPM 的速度,持续 5 分钟。
启动计算机程序,同时将大鼠放在转子杆环上。如果大鼠从环上脱落或五分钟后,结束试验并记录旋转时间。让大鼠休息30分钟,然后重复测试两次,并选择最大值作为最后一个旋转时间。
对于提升绳索测试,请将提升绳仪器放在书桌上。让老鼠用前肢抓住绳子,让它挂起来。记录挂起时间并计算分数。
在研究中脑动脉闭塞和再灌注引起的脑缺血损伤时,300克重3040螺纹螺栓和3小时脑梗死时间证明是最适合脑梗死、最长评分、最大模型成功率的。与275克重量、2636螺纹螺栓和两小时脑梗塞时间的传统处理相比,这一状况有了显著改善。为了研究脑缺血的恢复状态,TTC进行染色,发现中脑动脉闭塞和再灌注后第一天梗塞和收缩量为23.4%,35日为19.6%,60日为16.1%,90日为15.7%。
经过一天的中脑动脉闭塞和再灌注、感觉运动偏置在双边测数试验中、网格行走试验中的网格行走误差时间、提升绳试验中的吊绳得分都有所增加,而转子杆在转子杆试验中的转子杆时间减少,表明这些试验对急性脑缺血研究的重要性。只有感觉运动偏置保持大功能障碍与时间依赖的方式后,35,60和90天的中脑动脉闭塞和再灌注。对于网格行走测试,网格行走误差时间为35天和60天存在显著差异。
这些结果表明,这两项试验可能适合测试大鼠的恢复情况。为了确保成功,行动应该是温和的,操作应该是稳定的。其他行为测试(如步态检测)可能也适用于此模型。
这一模型的发展可以为研究人员在恢复和后遗症阶段探索脑缺血铺平道路。