Este estudo utiliza um modelo animal estabelecido para pesquisar a recuperação e os estágios de sequelas da isquemia cerebral. As principais vantagens desta técnica são que ela é estável, confiável e relativamente simples. Comece colocando um rato anestesiado em uma mesa de fixação cirúrgica.
Durante toda a cirurgia, mantenha a temperatura corporal do rato a 37 graus Celsius em um termostato animal pequeno. Conecte a boca à máscara da máquina de anestesia e confirme anestesia profunda por falta de tensão na extremidade, reflexos da córnea e dor. Fixar os membros do rato na mesa de operação usando ataduras de papel.
Com uma máquina de barbear elétrica, retire o casaco do pescoço e esterilize o pescoço com 75% de álcool. Use uma tesoura oftálmica para cortar de dois a três centímetros ao longo da forma longitudinal central do pescoço. E então com fórceps oftálmicos, separe o músculo subcutâneo.
Use retrátil caseiro para expor totalmente o campo de visão. Deve-se tomar cuidado para apresentar técnica asséptica adequada para todos os procedimentos cirúrgicos de sobrevivência. A técnica ilustrada posteriormente no vídeo deve ser praticada através de todo o procedimento.
Use os micro fórceps para isolar a artéria carótida comum, a artéria carótida externa e a artéria carótida interna. Trabalhando sob o microscópio, use 8-0 suturas para ligadurar a artéria carótida comum com nó duro, artéria carótida externa longe da extremidade do coração com nó duro, artéria carótida interna com nó solto e, em seguida, para forrar a artéria carótida externa perto da extremidade do coração. Usando micro tesoura, corte uma pequena abertura na artéria carótida externa e insira suavemente um parafuso de rosca.
Ligate a sutura da artéria carótida externa que é nó fino e solto e corte a artéria carótida externa. Solte o nó solto da artéria carótida interna e continue inserindo o parafuso do rosca até o início da artéria cerebral média marcada com a sutura e corte o parafuso de rosca exposto. Após o tempo isquêmico ser atingido após duas a três horas, fixe a fratura da artéria carótida externa usando micro fórceps e puxe suavemente o parafuso do rosca com outro micro fórceps.
Depois de retirar completamente a extremidade dianteira do parafuso da artéria carótida interna, ligar a artéria carótida externa que foi forrada com 8-0 sutura e, em seguida, remova o parafuso de rosca completamente. Depois de afrouxar a artéria carótida comum, dab aproximadamente 50.000 unidades de penicilina em pó de sódio na superfície da ferida para evitar infecções. Use quatro suturas para suturar músculos subcutâneos e pele.
Depois de colocar o rato de volta à gaiola, use uma seringa de um mililitro para dar aproximadamente 0,2 mililitros de água ao rato oralmente para evitar a desidratação pós-operatória. Escolha os animais de acordo com a pontuação mais longa para coloração TTC ou estudos motores sensoriais. Depois de incubar o cérebro isolado para coloração TTC a menos 20 graus Celsius de 30 minutos, coloque-o em um molde de fatia cerebral de rato pré-resfriado.
Usando uma lâmina pré-resfriada, corte o cérebro em seis seções consecutivas de dois milímetros de espessura. Colorique as seções com 2%TTC em uma placa de cultura de seis poços e incubar por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius enquanto treme. A cada 10 minutos, gire as seções até que a isquemia cerebral e as áreas não afetadas estejam visivelmente brancas e vermelhas.
Forrar o cérebro corta verticalmente o papelão preto para que de trás até a frente do cérebro usando uma régua para garantir que o comprimento total de cada linha seja o mesmo e tire fotos. Importe a foto e selecione as fatias cerebrais. Selecione o primeiro plano preto e digite Alt Delete para preencher a cor de fundo e, em seguida, controle D para desmarcar.
Finalmente, salve a imagem na área de trabalho. Para analisar o volume de infarto, primeiro abra o software e importe a foto. Para desertar a modificação, ajuste o brilho com a ferramenta de aprimoramento de contraste para que o fundo fique preto.
No filtro, use a ferramenta mediana para remover os destaques. Para calcular a área normal do cérebro esquerdo, selecione a cor usando segmentação e ajuste o valor de H, S e eu para separar as fatias cerebrais do fundo preto. Retorne ao tamanho da contagem e clique na contagem.
Clique em objetos divididos em edição para separar o cérebro da linha média que irá distinguir automaticamente as áreas cerebrais esquerda e direita. Para calcular a área cerebral infarto certa, importe a imagem, ajuste o plano de fundo e remova os destaques como feito anteriormente. Selecione o tamanho da contagem e clique na ferramenta desenhar objetos de mesclagem na edição.
Selecione manualmente a área isquêmica e clique na contagem para calcular a área isquêmica. Para calcular a área cerebral saudável certa, primeiro importe a imagem, ajuste o fundo e remova os destaques como feito anteriormente. Selecione a cor usando segmentação e ajuste o valor de H, S e eu para separar as fatias cerebrais saudáveis do fundo preto.
Retorne ao tamanho da contagem e clique na contagem para calcular esta área. Clique em objetos divididos em edição para separar o cérebro da linha média que irá distinguir automaticamente as áreas cerebrais esquerda e direita. Leve os ratos escolhidos para estudos motores sensoriais e para teste bilateral de assimemetria e enrole fita de papel na parte safena de cada garra frontal três vezes usando pressão igual.
Para cada rato, grave com a câmera o número de vezes que cada arranhão dianteira entra em contato e remove a fita dentro de cinco minutos, incluindo tempos de patas não afetados e afetados. Repita o embrulho e a gravação após 30 minutos e, em seguida, calcule os valores. Para o teste de caminhada na grade, coloque o rato no centro de uma plataforma de superfície de grade elevada com aberturas de 2,5 centímetros quadrados.
Empurre levemente os quadris do rato para incentivá-lo a se mover pela superfície. Usando a câmera, regise o número de falhas nos pés feitas pela direita não afetada e membros afetados e o número total do passo em um minuto com a câmera. Para o teste da haste do rotor, configure o aparelho de fadiga da barra giratória de rato a uma velocidade de 13 RPM durante um período de cinco minutos usando o software de suporte.
Inicie o programa de computador e coloque o rato nos anéis da haste do rotor ao mesmo tempo. Termine o teste se o rato cair do ringue ou depois de cinco minutos e registrar o tempo de rotação. Deixe o rato descansar por 30 minutos, depois repita o teste mais duas vezes e escolha o valor máximo como o último tempo de rotação.
Para o teste da corda de elevação, coloque o instrumento de corda de elevação sobre uma mesa. Que o rato segure a corda com seus membros dianteiros e deixe-a pendurada. Regissei o tempo de enforcamento e calcule as pontuações.
Quando foi estudada lesão isquêmica cerebral induzida pela oclusão e reperfusão da artéria cerebral média, 300 gramas de parafuso de linha de 3040 e tempo de infarto cerebral de três horas provou ser o mais adequado com o maior infarto cerebral, maior pontuação mais longa e maior razão de sucesso do modelo. Isso foi significativamente melhorado em comparação com o tratamento convencional de 275 gramas de peso, parafuso de 2636 fios e tempo de infarto cerebral de duas horas. Para estudar o estado de recuperação da isquemia cerebral, foi realizada a coloração TTC e revelou o volume de infarto e redução em 23,4% no primeiro dia após a oclusão e reperfusão da artéria cerebral média, 19,6% no 35º dia, 16,1% no dia 60 e 15,7% no dia 90.
Após um dia de oclusão e reperfusão da artéria cerebral média, viés motor sensorial no teste bilateral de assymetria, tempos de erro de caminhada na grade no teste de caminhada da grade e escore de corda de elevação no teste de corda de elevação são todos aumentados enquanto o tempo da haste do rotor no teste da haste do rotor diminuiu indicando a importância desses testes no estudo da isquemia cerebral aguda. Apenas o viés motor sensorial manteve grandes distúrbios funcionais com uma forma dependente do tempo após 35, 60 e 90 dias de oclusão e reperfusão da artéria cerebral média. Para o teste de caminhada na grade, houve diferenças significativas dos tempos de erro de caminhada na grade durante 35 e 60 dias.
Esses resultados indicaram que esses dois testes poderiam ser adequados para testar a recuperação em ratos. Para garantir o sucesso, a ação deve ser suave e a operação deve ser constante. Outros testes comportamentais, como a detecção de marcha, também podem ser adequados para este modelo.
O desenvolvimento desse modelo poderia abrir caminho para os pesquisadores explorarem a isquemia cerebral nos estágios de recuperação e sequelas.
