我々のプロトコルは、樹状細胞におけるHSV-1誘導オートファジー回転を効率的に妨害する方法を記述する。特に、感染前にオートファジーを遮断するsiRNAベースの戦略と阻害剤ベースを比較します。オートファジーに対する阻害剤ベースの干渉は潜在的および特異的なオフターゲット効果を含むが、我々の開発されたsiRNAベースの戦略はより標的特異的である。
重要なことに、提示された技術は、疾患の成熟段階に影響を与えない。この手順のデモンストレーションは、技術者のペトラ・ミュール=ズルベスと、私の研究室の卒業生であるアレクサンドラ・デュソーンです。4日目のポスト付着で、緩やかに接着性の細胞を細胞培養フラスコの底からそっとすすいで未熟な樹状細胞またはiDCを収穫することから始めます。
成熟した樹状細胞またはmDCを生成するために細胞に成熟カクテルを追加します。成熟誘導の2日後、細胞培養フラスコの底部からmDCをリンスする。リンスを2回繰り返し、iDCとmDCをそれぞれの培養培地中の50ミリリットルチューブに移します。
5分間300回gで遠心分離を介して細胞を収穫する。細胞培養フラスコあたり5~10ミリリットルのRPMI 1640で細胞を穏やかに再懸濁し、各DC懸濁液を1本のチューブに組み合わせます。次に、計数チャンバーを使用して細胞を定量化し、DCを扱う際の温度変化を避けるようにします。
200万個のiDCまたはmDCを2ミリリットルチューブに移し、3,390倍gで1〜1/2分間遠心し、上清を捨てます。感染培地中の細胞を穏やかに再懸濁する。10マイクロモル・スパイン-1または1ミクロモル・バフィロマイシンA1を感染の1時間前の感染培地に添加することにより、オートファゴソームリソソーム分解経路を阻害する。
未処理のコントロール用DMSOを追加し、300 RPMで振ると摂氏37度の加熱ブロック上の細胞をインキュベートします。感染研究のために、HSV-1ビリオンを有する細胞を2つの感染の多重度で接種する。MNTバッファーのそれぞれの体積をモックコントロールとして加え、摂氏37度の加熱ブロック上の細胞を揺れで1時間インキュベートします。
感染の1時間後、3分3、390回ggで1〜1/2分間遠心分離を経て細胞を採取し、接種物を穏やかに吸引し、DC培地中の細胞を再懸濁する。種子モック処理し、HSV-1感染細胞を6ウェルプレートに1ミリリットル当たり100万個の最終濃度で感染した。感染後16〜24時間で、細胞スクレーパーまたはmDCをリンスしてiDCを収穫し、細胞を1.5ミリリットルのセーフロックチューブに移し、3、390倍gの1〜1/2分間遠心分離で収集する。
ウェルに残った細胞を用いて収穫と遠心分離を繰り返し、その後、PBSの1ミリリットルでペレットを1回洗浄し、精力的にリシスミックスで細胞を再懸濁します。サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートし、摂氏95度まで10分間加熱します。SDSページおよびウェスタンブロット分析を実行して、LC3B1およびLC3B2、P62、ICP0およびICP5、およびGAPDHタンパク質レベルを検証します。
3.5日のポスト付着では、1,200万個のiDCを50ミリリットルチューブに移し、300倍gで5分間遠心し、上清を捨てます。並行して、フローサイトメトリック解析を実行して成熟状態を監視します。フェノールレッドなしで5ミリリットルのOpti-MEMでiDCを静かに洗い、遠心分離機を300gで5分間洗浄します。
上清を捨て、細胞濃度を100マイクロリットル当たり600万細胞に調整するOpti-MEMの200マイクロリットルで細胞を再懸濁する。FIP200特異的またはスクランブルされたsiRNAの75ピコモールを4ミリメートルのエレクトロキュベットに加え、100マイクロリットルの細胞懸濁液をそれぞれのキュベットに移します。エレクトロポレーション装置を使用してiDCを直接パルスします。
エレクトロポレーション後、iDCを新鮮な事前温められたDC培地で6ウェルプレートに移し、1ミリリットル当たり100万個の細胞の最終濃度で細胞を播種し、インキュベーターに入れる。48時間後、電気ポレートされたiDcの形態を顕微鏡で調べ、次に細胞スクレーパーで細胞を収穫し、15ミリリットルのチューブに移します。0.1%EDTAを補充したPBSの1ミリリットルでウェルをすすい、それぞれのチューブに溶液を移す。
次に、原稿に記載されているように、各siRNA条件に対する細胞を分割する。500,000個の細胞を使用して成熟状態と細胞生存率を評価し、ウェスタンブロット分析に100万個の細胞を使用してFIP200特異的なノックダウン効率を検証し、残りの細胞をHSV-1感染実験に使用します。生成されたiDCとmDCは、他の細胞タイプとの汚染を排除し、成熟状態を検証するために、フローサイトメトリーによって平定的に分析されました。
細胞をCD3およびCD14抗体で染色し、それぞれT細胞および単球汚染を排除した。細胞は、DCの高発現一般マーカーとして機能するCD11cについて染色した。成熟したDCで成熟状態を評価するために、CD80、CCR7、CD83、およびMHCII抗体が使用されました。
HSV-1を発現するEGFPによる感染を判定するために蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いた。強いGFP信号は、iDCとmDCのほぼ完全な感染を示します。ウェスタンブロット分析は、SPAUTIN-1またはバフィロマイシンA1がHSV-1感染細胞のオートファジーフラックスを阻害するかどうかを判断するために使用した。
iDCでは、オートファジーフラックスは、それぞれspautin-1およびbafilomycin A1の不在時のP62およびLC3B発現の低下によって示される。対照的に、spautin-1の不在時のmDCのHSV-1感染はP62発現に影響を及ぼさないが、spautin-1およびBA1治療はオートファジーの誘導を反映するLC3B-IIの蓄積を誘発したが、mDCにおけるオートファシー回転率の障害である。siRNAエレクトロポレーションを用いてFIP200タンパク質レベルを低下させることも、HSV-1感染iDCのオートファジーフラックスの強い減少を引き起こす。
オートファジーの阻害のためのこのsiRNAベースのエレクトロポレーションプロトコルは、細胞の生存率、画像表現型またはiDCにおけるHSV-1タンパク質発現の確立に影響を与えません。当社のエレクトロポレーションプロトコルは、疾患やその他の一次細胞タイプに明確なDNAまたはRNA種を送達する機会を提供します。その後、様々な分子、機能、および感染解析を行うことができます。
siRNAベースの疾患の発現サイレンシング戦略は、関心のあるタンパク質の機能を探求する道を開き、その後の機能アッセイと組み合わせる。
