我々は、ナノスケールの精度で、標準的な臨床組織セクションに関心のある生体分子を画像化するための低コスト測定である拡張病理、つまりExPathを提示しています。ExPathは、臨床組織部に水膨満水体を化学的に注入し、処理したサンプルを約100倍に物理的かつ均等に膨張させることによって、従来の光顕微鏡で従来の光顕微鏡の回折限界を回避し、従来の光学顕微鏡で蛍光標識された生体分子を分離して観察することを可能にする。ExPathを使用すると、新しいイメージングハードウェアに投資することなく、組織サンプル中の疾患関連生体分子のナノスケール構成を研究できます。
このように、病気の新しい洞察を可能にし、新しい診断を促進する。この方法は、幅広い組織タイプに適用でき、癌、脳疾患、自己免疫疾患などの様々な複雑な疾患の病因に関する新しい洞察を提供するために使用することができます。視覚的なデモンストレーションは、ゲル化チャンバーの構築や、プロテインナーゼK消化前後のゲル化サンプルの取り扱いなど、重要なステップを適切に行う方法を説明するために重要です。
まず、目的の組織を ExPath 互換フォーマットに変換します。FFPE臨床サンプルを使用する場合は、サンプルを50ml円錐チューブにスライドさせ、15mlのジレンを加えます。チューブをキャップし、約60rpmで軌道シェーカーの上に水平に3分間置きます。
別の15mlのゼレンで洗浄を繰り返します。次に、原稿の指示に従って、一連のエタノール希釈液でスライドを洗浄する。染色され、取り付けられた永久的なスライドで作業する場合は、50ml円錐形のチューブに各スライドを配置し、Zyleneでそれをカバーします。
カバースリップをカミソリの刃で慎重に取り外します。次いで、FFPE臨床サンプルと同様にスライドを処理する。OCT溶液で固定されていない凍結組織スライドを使用する場合は、アセトンの組織を摂氏20度で10分間固定し、1回の洗浄ごとに10分間、1X PBS溶液でサンプルを3回洗浄します。
事前に固定および凍結した臨床サンプルを処理する場合は、スライドを室温で2分間放置してOTC溶液を溶融させ、1回、1回の洗浄につき5分間、1X PBSで3回洗浄します。フォーマット変換後、全てのサンプルに対して抗原検索を行います。20ミリモルのクエン酸溶液を電子レンジで摂氏100度に加熱し、スライドを溶液に入れます。
すぐに容器をインキュベーションチャンバーに移し、摂氏60度で30分間インキュベートします。サンプルを染色するには、疎水性ペンを使用して、スライド上の組織セクションの周りに境界を描きます。スライドをシャーレに入れ、30°Cで1時間ブロッキングバッファーで組織をインキュベートします。
次いで、一次抗体溶液で組織を室温または摂氏37度で少なくとも3時間インキュベートする。インキュベーション後、ブロッキングバッファーで組織を3回洗浄し、室温で少なくとも1時間、または摂氏37度の二次抗体溶液中でインキュベートする。ブロッキングバッファーでのこのスリングを繰り返し、次いで、従来の広視野顕微鏡または他の選択した撮像システムを用いて蛍光イメージングを行う。
原稿の指示に従ってアンカーソリューションを準備します。スライドを100mlのシャーレに入れ、組織の上にアンカー溶液をパイプし、室温で少なくとも3時間インキュベートします。次に、原稿の指示に従ってゲル化液を調製する。
組織部分から余分なアンカー液を取り除き、スライドをシャーレに戻します。新鮮な冷たいゲル化液をサンプルに加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。サンプルの周りのスライドにチャンバーを構築するには、ダイヤモンドナイフでカバーガラスの断片を薄く切断することによってスペーサーを作成します。
ティッシュの両側のスペーサーを水で固定し、慎重にカバーグラスの蓋をスライドの上に置き、組織の上に気泡をトラップしないようにします。次に、加湿環境で37°Cでサンプルを2時間インキュベートします。カバースリップの下にそり刃をそっとスライドさせてゲル表面からゆっくりと持ち上げて、ゲル化チャンバーの蓋を取り除きます。
ティッシュの周りのブランクゲルをトリミングして体積を最小限に抑え、ゲルを非対称にカットして方向を追跡します。消化バッファーに1〜200を希釈プロテイナーゼ, 完全にゲルを水没させるのに十分な溶液を準備することを確認します.次に、溶液を60°Cで3時間閉じた容器に入れてサンプルをインキュベートする。
消化中にサンプルが切り離されない場合は、カミソリの刃を使用してそっと取り除きます。柔らかいペイントブラシを使用して、目的のイメージングシステムと互換性があり、完全に膨張したゲルに対応できる大きさの容器内の1X PBSに標本を移します。PBSでサンプルを10分間洗い、必要に応じて300ミリモルDAPIでレステインします。
1回の10分間、過剰量の二重蒸留水でサンプルを3~5回洗浄してサンプルを拡大します。次いで、蛍光イメージングを行う。このプロトコルが正常に実行されると、サンプルは機械的均質化後に平坦で透明なゲルとして現れ、水中で3〜4.5倍に拡大することができます。
5マイクロメートルの厚いFFPE腎臓サンプルを4.5回拡張し、その結果、0.95 NAの目的を使用して63ナノメートルの分解能が得られた。その後、組織を拡張病理適合形式に変換し、アルファアクチニン4およびビメンチン、DAPIが核DNAを視覚化し、小麦ゲルマグルテニンが炭水化物を標識するための抗体で染色した。次に、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、標本を画像化した。
腎臓組織は、その後、完全に水で拡張され、再び画像化されました.標識されたターゲットの割れ、歪み、損失は、不十分なアンカーまたは均質化の結果である可能性があります。ヘマトキシリンとエオシン染色された正常乳房組織を、FFPE試料として処理し、拡大し、DAPIで標識し、紡績ディスク共焦点顕微鏡で画像化した。
固定されていない腎臓のスライスと凍結した腎臓のスライスもこのプロトコルを使用して処理されました。組織を冷アセトンで固定し、アルファアクチン4、ビメンチン、DAPI、およびウィートゲルマグルテニンで染色した。この手法を行う場合、ゲル化工程のタイミングが重要であることを覚えておくことが重要である。
早期のゲル化は歪みを引き起こし、膨張を制限し、標的分子の損失を引き起こす可能性があります。この手順に従って、蛍光イメージングは、サンプルの消化および膨張後の顕微鏡上で行うことができる。ExPathは、病理学とそれ以降の両方で広く適用することができます。
それは研究者が興味のある組織サンプルの微妙な細部を視覚化することを可能にする。したがって、研究者は、疾患の病因や生物学的プロセスのメカニズムに関する新しい洞察を得るのに役立つ可能性があります。
