当社のプロトコルは、マイクロバイオームの研究と抗菌発見を助けることができる関心のある相互作用を特定するために、タンデムで多数の対の微生物相互作用をスクリーニングするための高スループット方法を提供します。この方法は、微生物が実験室条件下で培養に愛想が良い限り、様々なシステムにおける微生物相互作用の研究に容易に適用可能である。この技術の主な利点は、ユーザーが比較的短期間で多数の微生物相互作用をスクリーニングできることです。
この技術の新しいユーザーは、特にバイオアッセイプレートを接種する場合、過剰増殖や汚染を最小限に抑えるために注意することが重要であるため、時間がかかる必要があります。バイオアッセイプレートを接種するには、生物が井戸を過剰に成長させないように精度を必要とし、共培養物が汚染されていないことを保証するため、この技術の視覚的実証が重要です。一晩の文化を準備から始めます。
血清ピペットを使用して、BHIスープを3ミリリットルの14ミリリットル培養チューブに加えます。その後、細菌コロニーをスープに接種するために、滅菌1マイクロリットル接種ループを使用する。ループを旋回して、塊がスープに分散するようにします。
培養管を短時間渦液にし、250 RPMのシェーカーで摂氏37度で一晩インキュベートする。細菌培養物が1つ上のOD 600に達したら、それらを渦巻きして細胞の塊を分解する。1.5%寒天でPHI培地を調製し、オートクレーブで滅菌します。
その後、温度管理された水浴で媒体を摂氏55度に冷却し、溶融したBHI培地の3ミリリットルをプレート上の12の井戸のそれぞれに分配し、井戸が可能な限り均等であることを保証します。その後、寒天が一晩設定できるようにします。滅菌10マイクロリットルの接種ループを一晩培養に挿入し、培養液滴をプレートの左3分の1にストリークさせることで、バイオアッセイプレート上の試験生物を接種する。
プレート上の12個の井戸がすべて接種されるまで繰り返します。プレートを適度な温度で7日間、逆さまにインキュベートします。摂氏37度以上の温度で、または乾燥した気候でインキュベートする場合は、乾燥を防ぐために湿気の多い容器にプレートを保管してください。
バイオアッセイプレートの6日間のインキュベーションの後、先に述べたように標的生物の一晩培養を調製する。空の12ウェルプレートの各ウェルに1.8ミリリットルのBHI、および200マイクロリットルのターゲット夜間培養液を充填して、ターゲットプレートを準備します。無菌接種スタンプをターゲットプレートに入れる。
井戸の周りの文化を穏やかに渦巻き、隣接する井戸を交差しないようにします。接種スタンプを持ち上げ、スタンプ先端ごとに希釈されたターゲット培養液があることを確認します。接種スタンプを単剤化されたバイオアッセイプレートに置き、培養液滴が各井戸に接種するようにスタンプを穏やかに揺らします。
スタンプが取り除かれると、井戸に培養液が見えるはずです。いずれかのウェルが接種スタンプで接種されていない場合は、ピペットを使用してウェルに希釈された一晩培養物の3マイクロリットルを見つけます。次に、前述のようにバイオアッセイプレートを接種し、スタンプ先端を12ウェルプレートの右側に合わせて、スタンプが既存の細菌コロニーと接触しないようにします。
慎重にスタンプを取り出し、ターゲットプレートに戻します。寒天が不均一に井戸の中で固まった場合は、スタンプを前後にそっと揺らしますが、スタンプを試験生物の成長にシフトしないように注意してください。すべてのプレートが接種されるまで、各バイオアッセイプレートの接種を繰り返し、プレートを適切な温度で7日間逆さまにインキュベートします。
試験と標的生物を1週間共同培養した後、視覚評価に基づいて相互作用をスコア付けする。単一培養と区別がつかない成長を示す目標生物の成長をゼロとして井戸をスコア付けします。1つとして減少した成長で井戸をスコアし、2として成長なし。
ここで説明する共培養アッセイは、ヒトの鼻腔から分離されたブドウ球菌種標的生物に対する放細菌試験生物の阻害活性を評価するために使用した。合計812組のペアの組み合わせがテストされました。特に、コリネバクテリウム・プロピオクムは、特にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を弱く阻害したか、または阻害効果を有さない他のコリネバクテリアと比較して、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を強く阻害した。
比較ゲノミクスを用い、コリネバクテリウムプロパンクウムゲノムでシデロフォア産生のための生合成遺伝子クラスターが同定された。標準および鉄添加されたBHI培地を用いた共培養相互作用アッセイは、コリネバクテリウムプロピオンクウムとコアグラーゼ陰性ブドウ球菌との間の阻害表現型が実際には鉄依存であると判断した。プレートにスタンプを押す際には注意が必要です。
スタンプを押した後、各井戸を再確認し、汚染を防ぐために接種スタンプが正しく整列していることを確認してください。目的の相互作用を特定した後、微生物遺伝学およびゲノミクスを用いたその後の研究、天然物の単離および特性評価、またはイメージング質量分析を用いて、これらの相互作用の根底にあるメカニズムを特徴付けることができる。このプロトコルは、最近、ヒト鼻腔微生物叢間のシドロフォア媒介性競争を明らかにするために使用され、シフォマイシンと呼ばれる新しい抗真菌分子の発見に役立った。
