우리의 프로토콜은 미생물 군연구 및 항균 발견을 도울 수 있는 관심의 상호 작용을 확인하기 위해 많은 수의 쌍방향 미생물 상호 작용을 함께 선별하는 높은 처리량 방법을 제공합니다. 이 방법은 미생물이 실험실 조건 하에서 배양에 우호적인 한 다양한 시스템에서 미생물 상호 작용을 연구하는 데 쉽게 적용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 상대적으로 짧은 기간에 많은 수의 미생물 상호 작용을 선별 할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 새로운 사용자는 특히 생물 분석 판을 접종할 때 과성장이나 오염을 최소화하는 데 주의해야 하므로 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 기술의 시각적 데모는 생물 분석 판을 접종하는 것은 유기체가 우물을 과도하게 성장시키지 않고 공동 배양이 오염되지 않도록 정밀도가 필요하기 때문에 중요합니다. 하룻밤 문화를 준비하여 시작합니다.
세로지학적 파이펫을 사용하여 14밀리리터 배양 튜브에 3밀리리터의 BHI 국물을 추가하십시오. 그런 다음 세균성 식민지를 국물에 접종하기 위해 멸균 1 개의 마이크로 리터 접종 루프를 사용합니다. 루프를 소용돌이쳐 덩어리가 국물에 분산되도록 합니다.
배양 튜브를 잠시 소용돌이쳐 내고 250 RPM에서 셰이커에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 세균성 배양이 1개 이상의 OD 600에 도달하면 세포의 덩어리를 분해하기 위해 소용돌이를 가합니다. 1.5%의 천으로 PHI 미디어를 준비하고, 오토클레이브를 통해 살균합니다.
그런 다음 온도 조절 수조에서 미디어를 섭씨 55도로 냉각하고, 용융 된 BHI 매체의 3 밀리리터를 접시에 있는 12 개의 우물각각에 분배하여 우물이 가능한 한 균일하게 되도록합니다. 그런 다음 한천을 하룻밤 사이에 설정하도록 허용합니다. 멸균 10 마이크로리터 접종 루프를 하룻밤 배양에 삽입하고, 플레이트의 왼쪽 3분의 1에 배양액을 잘 줄임으로써 생체분석 판상에서 시험 유기체를 접종한다.
접시에 있는 모든 12개의 우물이 접종될 때까지 반복합니다. 7일 동안 적절한 온도에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다. 섭씨 37도 이상 또는 건조한 기후에서 배양하는 경우, 습한 용기에 접시를 저장하여 건조하지 않도록 하십시오.
바이오아세이 플레이트의 6일 배양 후, 이전에 설명한 바와 같이 대상 유기체의 하룻밤 배양을 준비한다. 1.8 밀리리터의 BHI, 대상 하룻밤 배양의 200 마이크로리터로 빈 12웰 플레이트의 각 웰을 채우고 대상 플레이트를 준비한다. 멸균 접종 스탬프를 대상 플레이트에 넣습니다.
우물 주위의 배양을 부드럽게 소용돌이치며, 이웃 우물을 교차 오염시키지 않도록 합니다. 접종 스탬프를 들어 올리고 각 스탬프 팁에 희석 대상 배양물 방울이 있는지 확인합니다. 접종 스탬프를 단장된 바이오아세이 플레이트에 놓고 스탬프를 부드럽게 흔들어 배양 액적방울이 각각 잘 접종되도록 합니다.
스탬프가 제거되면 우물에서 문화 물방울을 볼 수 있습니다. 접종 스탬프로 유정이 접종되지 않은 경우 파이펫을 사용하여 희석 된 하룻밤 문화의 3 개의 마이크로 리터를 우물에 발견하십시오. 그런 다음 이전에 설명한 바와 같이 생체 분석 판을 접종하지만 스탬프 팁을 12웰 플레이트의 오른쪽에 정렬하여 스탬프가 기존 세균 식민지에 접촉하지 않도록 합니다.
조심스럽게 스탬프를 제거하고 대상 플레이트에 다시 놓습니다. 한천이 우물에 고르지 않게 굳어지면 스탬프를 앞뒤로 부드럽게 흔들지만 스탬프를 시험 유기체 성장으로 옮기지 않도록 주의하십시오. 모든 플레이트가 접종될 때까지 각 생체 분석 판에 대한 접종을 반복한 다음 7일 동안 적절한 온도에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다.
1 주일 동안 시험 및 표적 유기체를 공동 배양 한 후, 시각적 평가에 따라 상호 작용을 점수. 단일문화와 구별할 수 없는 성장을 나타내는 목표 유기체 성장으로 우물을 0으로 점수. 하나의 성장 감소와 우물 점수, 그리고 두 로 성장하지.
여기에 설명된 공동 배양 분석은 인간 비강으로부터 분리된 유기체를 대상으로 한 액티노박테리아 시험 유기체의 억제 활성을 평가하는 데 사용되었다. 총 812쌍의 조합이 테스트되었습니다. 특히, 코린박테리움 프로빈쿰은 응고효소 네거티브 황색포도상구균을 강하게 억제했으며, 특히 응고효소 네거티브 황색포도상구균을 약화시키거나 억제 효과가 없는 다른 코린박테리아와 비교했을 때 특히 억제 효과가 없었다.
비교 유전체학의 사용을 통해, 측측산생산을 위한 생합성 유전자 클러스터가 코리네박테리움 프로인쿰 게놈에서 확인되었다. 표준 및 철 보충 BHI 배지를 이용한 공동 배양 상호 작용 분석은 코리네박테리움 프로빈쿰과 응고효소 네거티브 황색포도상구균 사이의 억제 표현형이 사실상 철에 의존적이었다는 것을 확인하였다. 접시에 스탬프를 찍을 때주의하는 것이 중요합니다.
스탬핑 후 각 우물을 다시 확인하고 접종 스탬프가 올바르게 정렬되어 오염을 방지하십시오. 관심의 상호 작용을 확인 한 후, 미생물 유전학및 유전체학을 사용하여 후속 연구, 천연 제품 격리 및 특성화, 또는 이미징 질량 분광법은 이러한 상호 작용의 기본 메커니즘을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최근에 인간 비강 미생물군유증 중의 측면 중재 경쟁을 발견하는 데 사용되었으며, cyphomycin에게 불린 새로운 항진균 분자의 발견에 원조되었습니다.
