Nuestro protocolo proporciona un método de alto rendimiento para el cribado de un gran número de interacciones microbianas en pares en conjunto para identificar interacciones de interés que pueden ayudar a la investigación del microbioma y el descubrimiento de antimicrobianos. Este método es fácilmente aplicable al estudio de las interacciones microbianas en una variedad de sistemas, siempre y cuando los microorganismos sean amables con el cultivo en condiciones de laboratorio. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los usuarios examinar un gran número de interacciones microbianas en un período relativamente corto de tiempo.
Los nuevos usuarios de esta técnica deben tomar tiempo, especialmente al inocular las placas de bioensayo, ya que es crucial tener cuidado de minimizar el crecimiento excesivo o la contaminación. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que la inoculación de las placas de bioensayo requiere precisión para garantizar que los organismos no sobreculpistan los pozos, y que los co-cultivos no están contaminados. Comience por preparar culturas de la noche a la mañana.
Utilice una pipeta serológica para añadir tres mililitros de caldo BHI en tubos de cultivo de 14 mililitros. Luego usa un bucle de inoculación estéril de un microlitro para inocular una colonia bacteriana en el caldo. Gire el lazo para asegurarse de que el grupo se dispersa en el caldo.
Vórtice brevemente los tubos de cultivo, e incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados en una coctelera a 250 RPM. Una vez que los cultivos bacterianos alcanzan un OD 600 por encima de uno, vórqueles para romper los grupos de células. Prepare medios de PHI con 1,5% de agar y ele por autoclaving.
A continuación, enfríe los medios a 55 grados centígrados en un baño de agua con temperatura controlada, y dispensa tres mililitros de medios BHI fundidos en cada uno de los 12 pozos en una placa, asegurando que los pozos sean lo más uniforme posible. Luego deja que el agar se ponga durante la noche. Inocular el organismo de prueba en una placa de bioensayo mediante la inserción de un bucle de inoculación estéril de 10 microlitro en el cultivo de la noche, y rayar la gota de cultivo sobre el tercio izquierdo de un pozo de placa.
Repita hasta que se hayan inoculado los 12 pozos de la placa. Incubar las placas boca abajo a la temperatura adecuada durante siete días. Si incuba a temperaturas superiores o iguales a 37 grados centígrados, o en climas más secos, guarde las placas en un recipiente húmedo para evitar que se sequen.
Después de la incubación de seis días de la placa de bioensayo, preparar cultivos nocturnos del organismo objetivo como se describió anteriormente. Prepare la placa de destino llenando cada pozo de una placa vacía de 12 pozos con 1,8 mililitros de BHI y 200 microlitros del cultivo nocturno objetivo. Coloque un sello de inoculación estéril en la placa de destino.
Arremete suavemente con las culturas alrededor de los pozos, asegurándose de que no se contaminen los pozos vecinos. Levante el sello de inoculación y asegúrese de que haya una gota de cultivo de destino diluido en cada punta de sello. Coloque el sello de inoculación en una placa de bioensayo sin inocular, y mece suavemente el sello para que la gota de cultivo inocule cada pocillo.
Una vez que se retira el sello, una gota de cultivo debe ser visible en los pozos. Si no se inocula ningún poz de pozo con el sello de inoculación, detecte tres microlitros de cultivo diluido durante la noche en los pozos utilizando una pipeta. A continuación, inocular las placas de bioensayo como se describió anteriormente, pero alinear las puntas del sello con el lado derecho de la placa de 12 pozos, asegurando que el sello no entra en contacto con la colonia bacteriana existente.
Retire con cuidado el sello y colóquelo de nuevo en la placa de destino. Si el agar se ha solidificado en los pozos de manera desigual, mezcle suavemente el sello de un lado a otro, pero tenga cuidado de no cambiar el sello al crecimiento del organismo de prueba. Repita la inoculación para cada placa de bioensayo hasta que se inoculen todas las placas, luego incubar las placas boca abajo a la temperatura adecuada durante siete días.
Después de co-cultivar la prueba y el organismo objetivo durante una semana, puntuar las interacciones basadas en la evaluación visual. Puntuar los pozos con el crecimiento del organismo objetivo que exhibe un crecimiento indistinguible del monocultivo como cero. Puntuar los pozos con un crecimiento disminuido como uno, y ningún crecimiento como dos.
Los ensayos de co-cultivo descritos aquí se utilizaron para evaluar la actividad inhibitoria de los organismos de prueba de actinobacteria hacia los organismos diana de la especie estafilococo aislados de la cavidad nasal humana. Se probaron un total de 812 combinaciones por pares. En particular, Corynebacterium propinquum inhibió fuertemente los estafilococos negativos de coagulasa, particularmente en comparación con otras Corynebacterias que ya sea inhibió débilmente los estafilococos negativos de coagulasa o no tenía efectos inhibitorios.
Mediante el uso de genómica comparativa, se identificó un grupo de genes biosintéticos para la producción de sideróforos en el genoma de Corynebacterium propinquum. Los ensayos de interacción de co-cultivo utilizando un medio BHI estándar y complementado con hierro determinaron que el fenotipo de inhibición entre Corynebacterium propinquum y coagulase negative staphylococci dependía en realidad del hierro. Es importante tener cuidado al estampar la placa.
Compruebe cada pozo después del estampado y asegúrese de que el sello de inoculación esté alineado correctamente para evitar la contaminación. Después de identificar interacciones de interés, se pueden utilizar estudios posteriores utilizando genética microbiana y genómica, aislamiento y caracterización de productos naturales o espectrometría de masas por imágenes para caracterizar los mecanismos subyacentes a estas interacciones. Este protocolo se ha utilizado recientemente para descubrir la competencia mediada por sideróforo entre la microbiota nasal humana, y ayudó en el descubrimiento de una nueva molécula antifúngica llamada cihitomicina.
