Protokolümüz, mikrobiyom araştırmalarına ve antimikrobiyal keşiflere yardımcı olabilecek ilgi etkileşimlerini belirlemek için çok sayıda çift yönlü mikrobiyal etkileşimin birlikte taranması için yüksek bir üretim yöntemi sunmaktadır. Bu yöntem, mikroorganizmalar laboratuvar koşullarında kültüre sevimli olduğu sürece, çeşitli sistemlerdeki mikrobiyal etkileşimlerin incelenmesi için kolayca uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanıcıların nispeten kısa bir süre içinde mikrobiyal etkileşimleri çok sayıda ekran sağlar.
Bu tekniğin yeni kullanıcıları zaman almalıdır, özellikle biyoassay plakaları aşılarken, aşırı büyüme veya kontaminasyonu en aza indirmek için dikkatli olmak çok önemlidir. Bu tekniğin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü biyoassay plakalarının aşılandırılması, organizmaların kuyuları aşmamasını ve ortak kültürlerin kirlenmemesini sağlamak için hassasiyet gerektirir. Bir gecede kültürler hazırlayarak başlayın.
14 mililitrelik kültür tüpleri içine BHI suyu üç mililitre eklemek için bir serolojik pipet kullanın. Sonra et suyu içine bir bakteri koloniaşılamak için steril bir mikrolitre aşılama döngü kullanın. Kümenin et suyuna dağılmasını sağlamak için döngüyü döndürün.
Kısaca kültür tüplerini girdap ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıyla bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kültürleri bir od 600 yukarıda ulaşmak kez, onları girdap hücrelerin kümeleri kırmak için. PHI ortamını %1,5 agar ile hazırlayın ve otoklavlayarak sterilize edin.
Daha sonra ortamları sıcaklık kontrollü bir su banyosunda 55 dereceye kadar soğutun ve bir tabaktaki 12 kuyunun her birine üç mililitre erimiş BHI media dağıtın ve kuyuların mümkün olduğunca eşit olmasını sağlar. Sonra agar bir gecede ayarlamak için izin verin. Bir gecede kültür içine steril 10 mikrolitre aşılı döngü ekleyerek bir biyoassay plaka üzerinde test organizma aşılamak, ve iyi bir plaka nın sol üçte üzerinde kültür damlacık çizgili.
Plakadaki 12 kuyunun tümü aşılanana kadar tekrarlayın. Plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derecenin üzerinde veya daha kuru iklimlerde kuluçkaya yalıyorsanız, kurumasını önlemek için plakaları nemli bir kapta saklayın.
Biyoassay plakasının altı günlük kuluçkadan sonra, daha önce açıklandığı gibi hedef organizmanın gece kültürlerini hazırlayın. BhI 1.8 mililitre ve hedef gece kültürü 200 mikrolitre ile boş bir 12-kuyu plaka her kuyu doldurarak hedef plaka hazırlayın. Hedef plakaya steril aşı damgası yerleştirin.
Yan kuyuları çapraz kirletmemelerini sağlayarak, kuyuların etrafındaki kültürleri yavaşça döndürün. Aşı lama damgasını kaldırın ve her pul ucunda seyreltilmiş hedef kültür damlacıkları olduğundan emin olun. Aşılama damgasını aşılanmamış bir biyoassay plakasına yerleştirin ve pulu nazikçe sallayın, böylece kültür damlacığı her kuyuyu aşılatır.
Pul kaldırıldıktan sonra, kuyularda bir kültür damlası görülmelidir. Aşı damgası ile aşılanan herhangi bir kuyu yoksa, bir pipet kullanarak kuyulara seyreltilmiş bir gecede kültür üç mikrolitre nokta. Daha sonra bioassay plakalarını daha önce açıklandığı gibi aşılama, ancak pulun mevcut bakteri kolonisiyle temas etmediğinden emin olmak için pul uçlarını 12 kuyulu plakanın sağ tarafıyla hizalayın.
Pulu dikkatlice çıkarın ve hedef plakaya geri yerleştirin. Agar kuyularda eşit olmayan bir şekilde katılaşmışsa, pulu yavaşça ileri geri sallayın, ancak damgayı test organizması büyümesine kaydırmamaya dikkat edin. Tüm plakalar aşılanana kadar her biyoassay plakası için aşıyı tekrarlayın, ardından plakaları yedi gün boyunca uygun sıcaklıkta baş aşağı kuluçkaya yatırın.
Bir hafta boyunca test ve hedef organizmayı bir arada yaptıktan sonra, görsel değerlendirmeye dayalı etkileşimleri puan. Tekkültürden ayırt edilemez bir büyüme gösteren hedef organizma büyümesi ile kuyuları sıfır olarak puan. Bir olarak azalmış büyüme ile kuyupuan ve iki olarak büyüme yok.
Burada açıklanan ortak kültür tahlilleri, insan burun boşluğundan izole edilmiş stafilokok türlerine doğru aktinobakteri test organizmalarının inhibitör aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Toplam 812 çift biliş test edildi. Özellikle, Corynebacterium propinquum kuvvetle koagülaz negatif stafilokoki inhibe, diğer Corynebacteria karşılaştırıldığında özellikle ya zayıf koagülaz negatif stafilokok inhibe veya hiçbir inhibitör etkisi yoktu.
Karşılaştırmalı genomik kullanımı sayesinde Corynebacterium propinquum genomunda siderofor üretimi için biyosentetik bir gen kümesi tanımlanmıştı. Standart ve demir takviyesi BHI ortamı kullanılarak yapılan co-kültür etkileşim iratları, Corynebacterium propinquum ve koagülaz negatif stafilokokları arasındaki inhibisyon fenotipinin aslında demire bağımlı olduğunu belirlemiştir. Plakayı damgalarken dikkatli olmak önemlidir.
Damgalamadan sonra her bir kuyuyu iki kez kontrol edin ve kontaminasyonu önlemek için aşılama damgasının doğru şekilde hizalandığından emin olun. İlgi etkileşimleri tespit edildikten sonra, mikrobiyal genetik ve genomik, doğal ürün izolasyonu ve karakterizasyonu veya bu etkileşimlerin altında yatan mekanizmaları karakterize etmek için görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak yapılan sonraki çalışmalar kullanılabilir. Bu protokol son zamanlarda insan nazal mikrobiyota arasında siderophore aracılı rekabet ortaya çıkarmak için kullanılan ve sifomisin denilen yeni bir antifungal molekülün keşfi yardımcı oldu.
