يوفر بروتوكولنا طريقة عالية الإنتاجية لفحص عدد كبير من التفاعلات الميكروبية الزوجية جنبًا إلى جنب لتحديد التفاعلات ذات الاهتمام التي يمكن أن تساعد في أبحاث الميكروبيوم واكتشاف مضادات الميكروبات. هذه الطريقة قابلة للتطبيق بسهولة لدراسة التفاعلات الميكروبية في مجموعة متنوعة من النظم ، طالما أن الكائنات الدقيقة ودية في الثقافة في ظل ظروف المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمستخدمين بفحص عدد كبير من التفاعلات الميكروبية في فترة زمنية قصيرة نسبيًا.
وينبغي أن يستغرق المستخدمون الجدد لهذه التقنية بعض الوقت، لا سيما عند تلقيح لوحات المواد البيولوجية، حيث أنه من الأهمية بمكان أن نكون حذرين لتقليل فرط النمو أو التلوث. إن التوضيح المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية، لأن تلقيح ألواح اٍلباس حيوي يتطلب الدقة لضمان عدم إفراط الكائنات الحية في الآبار، وعدم تلوث الثقافات المشتركة. تبدأ من خلال إعداد الثقافات بين عشية وضحاها.
استخدام ماصة المصلية لإضافة ثلاثة ملليلتر من مرق BHI في أنابيب ثقافة 14 ملليلتر. ثم استخدم حلقة مُعقمة من المُضق الصغيرة لتطعيم مستعمرة بكتيرية في المرق. دوامة الحلقة لضمان أن كتلة ينثر في مرق.
دوامة وجيزة أنابيب الثقافة، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على شاكر في 250 دورة في الدقيقة. بمجرد أن تصل الثقافات البكتيرية إلى 600 OD فوق واحد ، دوامة لهم لتفريق كتل من الخلايا. إعداد وسائل الإعلام PHI مع 1.5٪ agar، وتعقيمه عن طريق autoclaving.
ثم تبريد وسائل الإعلام إلى 55 درجة مئوية في حمام الماء التي تسيطر عليها درجة الحرارة، والاستغناء عن ثلاثة ملليلتر من وسائل الإعلام BHI المنصهرة في كل من الآبار 12 على لوحة، وضمان أن الآبار هي حتى حتى ممكن. ثم السماح لأجار لتعيين بين عشية وضحاها. اطعن كائن الاختبار على لوحة الفحص الحيوي عن طريق إدخال حلقة تطعيم معقمة 10 ميكروليتر في الثقافة بين عشية وضحاها ، و streaking قطرات الثقافة على الثلث الأيسر من لوحة بشكل جيد.
كرر حتى تم تلقيح جميع الآبار الـ 12 على اللوحة. احتضان لوحات رأسا على عقب في درجة الحرارة المناسبة لمدة سبعة أيام. إذا كان احتضان في درجات حرارة أكبر من أو يساوي 37 درجة مئوية، أو في المناخات الأكثر جفافا، وتخزين لوحات في وعاء رطب لمنعها من الجفاف.
بعد فترة ستة أيام من حضانة لوحة اٍيوب، إعداد الثقافات بين عشية وضحاها للكائن الحي المستهدف كما هو موضح سابقا. إعداد لوحة الهدف عن طريق ملء كل بئر من لوحة فارغة 12-جيدا مع 1.8 ملليلتر من BHI، و 200 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها الهدف. وضع ختم تطعيم معقمة في لوحة الهدف.
دوامة بلطف الثقافات حول الآبار، وضمان أنها لا تلوث عبر الآبار المجاورة. ارفع ختم التطعيم، وتأكد من وجود قطرة من ثقافة الهدف المخففة على كل طرف طابع. ضع ختم التطعيم على لوحة اٍيحي غير منطّحة، وهز الطابع بلطف بحيث تُطعم قطرات الثقافة كل بئر.
وبمجرد إزالة الطابع، ينبغي أن تكون قطرات من الثقافة مرئية في الآبار. إذا لم يتم تلقيح أي آبار مع ختم التطعيم ، بقعة ثلاثة ميكروليترز من ثقافة بين عشية وضحاها مخففة على الآبار باستخدام ماصة. ثم تلقيح لوحات اٍيائي كما سبق وصفه، ولكن محاذاة نصائح الطوابع مع الجانب الأيمن من لوحة 12-جيدا، وضمان أن الطابع لا يتصل مستعمرة البكتيريا الموجودة.
إزالة بعناية الطابع، ووضعها مرة أخرى في لوحة الهدف. إذا كان أجار قد توطدت في الآبار بشكل غير متساو، صخرة بلطف ختم ذهابا وإيابا، ولكن يجب الحرص على عدم تحويل الطابع إلى نمو الكائن الحي الاختبار. كرر التلقيح لكل لوحة من الألواح الحيوية حتى تلقيح جميع اللوحات، ثم يحضن اللوحات رأسا على عقب في درجة الحرارة المناسبة لمدة سبعة أيام.
بعد المشاركة في زراعة الاختبار والهدف من الكائن الحي لمدة أسبوع واحد ، وتسجيل التفاعلات على أساس التقييم البصري. تسجيل الآبار مع نمو الكائن الحي المستهدف الذي يسلك نموًا لا يمكن تحديده من الزراعة الأحادية كصفر. تسجيل الآبار مع انخفاض النمو كواحد، ولا نمو كاثنين.
واستخدمت مقايسات الثقافة المشتركة الموصوفة هنا لتقييم النشاط المثبط للكائنات الحية اختبار actinobacteria نحو الكائنات العنقودية المستهدفة الكائنات الحية المعزولة عن تجويف الأنف البشري. تم اختبار ما مجموعه 812 تركيبات زوج. وتجدر الإشارة إلى أن كورينباكتيريوم بروبينكووم منع بقوة المكورات العنقودية السلبية coagulase، لا سيما بالمقارنة مع كورينباكتيريا الأخرى التي إما تثبيط coagulase المكورات العنقودية السلبية أو لم يكن لها أي آثار مثبطة.
ومن خلال استخدام الجينوم المقارن، تم تحديد مجموعة جينات مركّزة بيولوجية لإنتاج الدعامات الجانبية في جينوم بروبينكوم Corynebacterium. شارك في الثقافة التفاعل المقايسة باستخدام معيار والحديد تكمل BHI المتوسطة قررت أن النمط الظاهري تثبيط بين Corynebacterium propinquum وcoagulase المكورات العنقودية السلبية كان في الواقع تعتمد على الحديد. من المهم أن نكون حذرين عند ختم لوحة.
تحقق من كل بئر بعد الختم ، وتأكد من محاذاة ختم التطعيم بشكل صحيح لمنع التلوث. بعد تحديد التفاعلات ذات الاهتمام، يمكن استخدام الدراسات اللاحقة باستخدام علم الوراثة الميكروبية وعلم الجينوم، وعزل المنتجات الطبيعية وتوصيفها، أو تصوير قياس الطيف الكتلي لتوصيف الآليات التي تقوم عليها هذه التفاعلات. وقد استخدم هذا البروتوكول مؤخرا للكشف عن المنافسة التي بوساطة siderophore بين ميكروبيوتا الأنف الإنسان، وساعد في اكتشاف جزيء مضاد للفطرات يسمى سيشوميسين.
