הפרוטוקול שלנו מספק שיטת תפוקה גבוהה לסינון מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאליות בזוגיות בד בבד כדי לזהות אינטראקציות מעניינות שיכולות לסייע במחקר מיקרוביום וגילוי מיקרוביאלי. שיטה זו ישימה בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות במגוון מערכות, כל עוד המיקרואורגניזמים חביבים לתרבות בתנאי מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמשים לסנן מספר רב של אינטראקציות מיקרוביאליות בתקופה קצרה יחסית של זמן.
משתמשים חדשים של טכניקה זו צריך לקחת זמן, במיוחד בעת חינוך צלחות bioassay, כפי שהוא חיוני כדי להיות זהיר כדי למזער את חקלאות יתר או זיהום. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, כי חינוך לוחות bioassay דורש דיוק כדי להבטיח כי האורגניזמים לא להחרים את בארות, כי תרבויות שיתוף אינם מזוהמים. התחל בהכנת תרבויות לילה.
השתמש פיפטה סרולוגית להוסיף שלושה מיליליטר של מרק BHI לתוך צינורות תרבות 14 מיליליטר. לאחר מכן השתמש בלולאת חיסון מיקרוליטר אחת סטרילית כדי לחסן מושבת חיידקים לתוך המרק. מערבלים את הלולאה כדי להבטיח שהגוש יתפזר לתוך המרק.
בקצרה מערבולת צינורות התרבות, ו דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר ב 250 סל"ד. ברגע שתרבות החיידקים מגיעות למנת יתר של 600 מעלות מעל אחת, מערבולת אותן כדי לשבור את גושי התאים. הכינו את המדיה PHI עם 1.5% אגר, וערקו אותה באמצעות הפעלה אוטומטית.
ואז לקרר את התקשורת ל 55 מעלות צלזיוס באמבט מים מבוקר טמפרטורה, ולחלק שלושה מיליליטר של מדיה BHI מותכת לתוך כל אחת 12 בארות על צלחת, להבטיח כי הבארים הם אפילו ככל האפשר. אז לאפשר אגר להגדיר לילה. לחסן את אורגניזם הבדיקה על צלחת bioassay על ידי החדרת לולאה סטרילית 10 מיקרוליטר חיסון לתוך תרבות הלילה, ו streaking טיפת התרבות על החלק השמאלי של צלחת היטב.
חזור על הפעולה עד שכל 12 בארות על הצלחת כבר מחוסן. הדגירה את הצלחות במהופך בטמפרטורה המתאימה במשך שבעה ימים. אם הדגירה בטמפרטורות גדולות או שוות ל-37 מעלות צלזיוס, או באקלים יבש יותר, יש לאחסן את הצלחות במיכל לח כדי למנוע מהן להתייבש.
לאחר הדגירה בת ששת הימים של צלחת הביואסאי, הכינו תרבויות לילה של אורגניזם המטרה כמתואר קודם לכן. הכן את צלחת היעד על ידי מילוי כל באר של צלחת ריקה 12 באר עם 1.8 מיליליטר של BHI, ו 200 microliters של תרבות הלילה היעד. מניחים חותמת חיסון סטרילית לתוך לוחית המטרה.
מערבבים בעדינות את התרבויות סביב בארות, ומבטיחים שהן לא יזהמו את בארות השכנות. הרם את חותמת החיסון, וודא שיש טיפה של תרבות יעד מדוללת על כל קצה בול. מניחים את חותמת החיסון על צלחת ביו-אסאי לא מחוסן, ומטלטלים בעדינות את החותמת כך שטיפת התרבות חונקת כל באר.
לאחר הסרת החותמת, טיפת תרבות צריכה להיות גלויה בארות. אם בארות כלשהן אינן מחוסנות עם חותמת החיסון, ספוט שלושה microliters של תרבות לילה מדוללת על בארות באמצעות פיפטה. לאחר מכן לחסן את הלוחות bioassay כפי שתואר קודם לכן, אבל ליישר את קצות הבול עם הצד הימני של צלחת 12 באר, להבטיח כי החותמת אינה יוצרת קשר עם המושבה החיידקית הקיימת.
מוציאים בזהירות את החותמת ומ מניחים אותה בחזרה לתוך לוחית המטרה. אם אגר התגבש בארות בצורה לא אחידה, בעדינות רוק את החותמת קדימה ואחורה, אבל להיזהר לא להעביר את החותמת לתוך הצמיחה אורגניזם הבדיקה. חזור על החיסון עבור כל צלחת bioassay עד שכל הצלחות מחוסנות, ולאחר מכן להחגירה את הצלחות במהופך בטמפרטורה המתאימה במשך שבעה ימים.
לאחר שיתוף culturing המבחן ואת האורגניזם היעד במשך שבוע אחד, ציון האינטראקציות מבוסס על הערכה חזותית. ציון הבארות עם צמיחת אורגניזם היעד המציג צמיחה בלתי ניתנת להבחנה מן המונוקולטורה כאפס. ציון בארות עם צמיחה מופחתת כאחד, ואין צמיחה כמו שתיים.
הראיה של התרבות ה-שותף המתוארת כאן שימשה להערכת הפעילות המעכבת של אורגניזמים לבדיקת אקטינובקטריה כלפי מיני סטפילוקוקוס שמכוונים לאורגניזמים המבודדים חלל האף האנושי. בסך הכל נבדקו 812 שילובים בזוגות. יש לציין, קורינבקטריום propinquum מעכב מאוד staphylococci שלילי coagulase, במיוחד בהשוואה לקורינבקטריה אחרים כי גם מעכב חלש סטפילוז שלילי staphylococci או לא היו השפעות מעכבות.
באמצעות שימוש בגנומיקה השוואתית, זוהה צביר גנים ביוסינתטי לייצור siderophore בגנום ה propinquum של קורינבקטריום. בדיקת אינטראקציה של תרבות-משותף באמצעות מדיום BHI סטנדרטי בתוספת ברזל קבעה כי פנוטיפ העיכוב בין פרופינקום קורינבקטריום ו staphylococci שלילי coagulase היה למעשה תלוי ברזל. חשוב להיות זהיר בעת החתמת הצלחת.
בדוק פעמיים כל באר לאחר ההחתמה, וודא שחותמת החיסון מיושרת כראוי כדי למנוע זיהום. לאחר זיהוי אינטראקציות של עניין, מחקרים הבאים באמצעות גנטיקה מיקרוביאלית וגנומיקה, בידוד ואפיון של מוצרים טבעיים, או ספקטרומטריית מסה הדמיה ניתן להשתמש כדי לאפיין מנגנונים שבבסיס אינטראקציות אלה. פרוטוקול זה שימש לאחרונה כדי לחשוף תחרות מתווך siderophore בקרב מיקרוביוטה האף האנושי, וסייע בגילוי של מולקולה אנטי פטרייתית חדשה בשם cyphomycin.
