Unser Protokoll bietet eine Methode mit hohem Durchsatz zum Screening einer großen Anzahl paarweiser mikrobiellen Wechselwirkungen im Tandem, um Wechselwirkungen von Interesse zu identifizieren, die mikrobiomische Forschung und antimikrobielle Entdeckung unterstützen können. Diese Methode ist leicht anwendbar für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Systemen, solange die Mikroorganismen unter Laborbedingungen kulturfähig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Benutzern ermöglicht, eine große Anzahl von mikrobiellen Wechselwirkungen in relativ kurzer Zeit zu überprüfen.
Neue Anwender dieser Technik sollten sich Zeit nehmen, insbesondere bei der Impfung der Bioassayplatten, da es wichtig ist, vorsichtig zu sein, über wachsenoder Kontamination zu minimieren. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Impfung der Bioassayplatten Präzision erfordert, um sicherzustellen, dass die Organismen die Brunnen nicht überwuchern und die Kokulturen nicht kontaminiert sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Nachtkulturen.
Verwenden Sie eine serologische Pipette, um drei Milliliter BHI-Brühe in 14-Milliliter-Kulturröhren hinzuzufügen. Verwenden Sie dann eine sterile einMikroliter-Impfschleife, um eine Bakterienkolonie in die Brühe zu impfen. Wirbeln Sie die Schleife, um sicherzustellen, dass sich der Klumpen in die Brühe verteilt.
Kurz wirbeln die Kulturröhren, und bebrüten sie über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker bei 250 U/min. Sobald die Bakterienkulturen eine OD 600 über eins erreichen, wirbeln sie, um die Klumpen von Zellen aufzubrechen. Bereiten Sie PHI-Medien mit 1,5% Agar vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren.
Dann kühlen Sie die Medien in einem temperaturgeregelten Wasserbad auf 55 Grad Celsius ab und geben Sie drei Milliliter geschmolzener BHI-Medien in jeden der 12 Brunnen auf einer Platte aus, damit die Brunnen so gleichmäßig wie möglich sind. Dann lassen Sie den Agar über Nacht setzen. Impfen Sie den Testorganismus auf einer Bioassayplatte, indem Sie eine sterile 10-Mikroliter-Impfschleife in die Nachtkultur einfügen und das Kulturtröpfchen über das linke Drittel eines Plattenbrunnens streifen.
Wiederholen Sie dies, bis alle 12 Bohrungen auf der Platte geimpft wurden. Inkubieren Sie die Platten sieben Tage lang bei entsprechender Temperatur auf den Kopf. Wenn Sie bei Temperaturen von mehr als oder gleich 37 Grad Celsius oder in trockeneren Klimazonen brüten, lagern Sie die Platten in einem feuchten Behälter, um zu verhindern, dass sie austrocknen.
Nach der sechstägigen Inkubation der Bioassayplatte, bereiten Sie über Nacht Kulturen des Zielorganismus wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie die Zielplatte vor, indem Sie jeden Brunnen einer leeren 12-Well-Platte mit 1,8 Milliliter NHI und 200 Mikrolitern der Ziel-Übernachtungskultur füllen. Legen Sie einen sterilen Impfstempel in die Zielplatte.
Wirbeln Sie die Kulturen sanft um die Brunnen und sorgen Sie dafür, dass sie benachbarte Brunnen nicht verunreinigen. Heben Sie den Impfstempel an, und stellen Sie sicher, dass sich auf jeder Stempelspitze ein Tröpfchen verdünnter Zielkultur befindet. Legen Sie den Impfstempel auf eine uninokulierte Bioassay-Platte und schaukeln Sie den Stempel sanft, so dass das Kulturtröpfchen jeden Brunnen impft.
Sobald der Stempel entfernt ist, sollte ein Tröpfchen Kultur in den Brunnen sichtbar sein. Wenn keine Brunnen nicht mit dem Impfstempel geimpft werden, erkennen Sie mit einer Pipette drei Mikroliter verdünnter Nachtkultur auf die Brunnen. Dann impfen Sie die Bioassay-Platten wie zuvor beschrieben, richten Sie aber die Stempelspitzen an der rechten Seite der 12-Well-Platte aus, um sicherzustellen, dass die Marke nicht mit der bestehenden Bakterienkolonie in Berührung kommt.
Entfernen Sie den Stempel vorsichtig und legen Sie ihn wieder in die Zielplatte. Wenn sich der Agar in den Brunnen ungleichmäßig verfestigt hat, schaukeln Sie den Stempel sanft hin und her, aber achten Sie darauf, den Stempel nicht in das Wachstum des Testorganismus zu verschieben. Wiederholen Sie die Impfung für jede Bioassayplatte, bis alle Platten geimpft sind, und brüten Sie die Platten dann sieben Tage lang bei der entsprechenden Temperatur auf den Kopf.
Nachdem Sie den Test- und Zielorganismus eine Woche lang mitgeprägt haben, bewerten Sie die Wechselwirkungen anhand einer visuellen Bewertung. Bewerten Sie die Brunnen mit dem Zielorganismuswachstum, das ein ununterscheidbares Wachstum von der Monokultur als Null aufweist. Erzielen Sie die Brunnen mit verringertem Wachstum als eins, und kein Wachstum als zwei.
Die hier beschriebenen Co-Kultur-Assays wurden verwendet, um die hemmende Aktivität der Actinobacteria-Testorganismen gegenüber den Staphylokokken-Arten als Zielorganismen zu bewerten, die aus der menschlichen Nasenhöhle isoliert sind. Insgesamt wurden 812 paarweise Kombinationen getestet. Insbesondere, Corynebacterium propinquum stark gehemmt Koagulase negative Staphylokokken, vor allem im Vergleich zu anderen Corynebacteria, die entweder schwach gehemmt Koagulase negative Staphylokokken oder hatte keine hemmende Wirkung.
Durch den Einsatz vergleichender Genomik wurde im Corynebacterium propinquum Genom ein biosynthetischer Gencluster zur Siderophorproduktion identifiziert. Co-Kultur-Interaktions-Assays mit Standard- und eisenergänztem BHI-Medium stellten fest, dass der Hemmungsphänotyp zwischen Corynebacterium propinquum und coagulase negative Staphylokokken tatsächlich eisenabhängig war. Es ist wichtig, beim Stanzen der Platte vorsichtig zu sein.
Überprüfen Sie jeden Brunnen nach dem Stempeln, und stellen Sie sicher, dass der Impfstempel korrekt ausgerichtet ist, um eine Kontamination zu verhindern. Nach der Identifizierung von Wechselwirkungen von Interesse können nachfolgende Studien mit mikrobiellen Genetik und Genomik, natürliche Produktisolation und Charakterisierung oder bildgebende Massenspektrometrie verwendet werden, um Mechanismen zu charakterisieren, die diesen Wechselwirkungen zugrunde liegen. Dieses Protokoll wurde vor kurzem verwendet, um Siderophor-vermittelten Wettbewerb unter der menschlichen Nasenmikrobiota aufzudecken, und half bei der Entdeckung eines neuen antimyktischen Moleküls namens Cyphomycin.
