このプロトコルは、樹状樹状アーバーの分岐ダイナミクスを定量化し、ライブタイムラプスイメージングと3D画像注釈ソフトウェアを使用してニューロンを開発するための新しいアプローチを提供します。この技術は、樹状フィロポディアの動的挙動を測定するための迅速かつ効率的な方法を提供する分岐端子を画像および追跡します。この方法を用いた研究は、開発と活動がデンドライト形態素形成を調節する方法を理解する洞察を提供する。
我々の方法は、インビトロおよびインビボ設定の両方でまばらな標識ニューロンに適用可能である。この手順を実行する場合は、十分な時間的および空間的解像度を達成するために、イメージング パラメータを慎重に調整する必要があることに注意してください。幼虫ショウジョウバエから脳を収穫するために、解剖顕微鏡の下で、第5種の標準的な先端解剖鉗子の1組を使用して幼虫標本を所定の位置に保持し、もう1つを使用して慎重に脳を解剖し、眼球盤、脳LOB、および腹側神経コードを維持する。
次に、取り付けられた筋肉を取り除き、イメージング中のサンプルの動きを最小限に抑えます。すべての脳が収穫されたら、真空グリースを使用して正方形の部屋をガラススライドに引き出し、20マイクロリットルの外部生理食塩水をチャンバーに加えます。鉗子を使用して脳をチャンバーに移し、後側を上に向けて顕微鏡下の脳の位置を調整します。
ガラスカバースリップでチャンバーを覆い、カバースリップを軽く押して、イメージング手順中のサンプルの漂流を減らします。個別に標識されたニューロンを含む脳外植を同定するために、解剖の30分以内に40X水浸漬目的および発蛍光光源を選択する。920ナノメートルと非Dscan検出器に調整された2つの光子レーザーを選択し、画像をフレームあたり512 x 512ピクセル、Zスタックあたり1分で10分間収集するイメージングパラメータを設定します。
次に、光ズームとデジタルズームを調整して十分なX、Y、Z解像度を達成し、樹状樹状の樹状アーバー全体のカバレッジを1分以内に確保します。この設定では、0.11 x 0.11 x 0.25 マイクロメートルの標準 X、Y、Z 解像度のイメージが生成されます。ドリフト補正の場合は、適切なドリフト補正ソフトウェアプログラムで目的のファイルを開き、[微視的パラメータを編集および編集]をクリックします。
2 つのフォトン オプションがある場合は、2 つのフォトン 画像の顕微鏡の種類を [広視野] に設定し、ソフトウェアで定義されたワークフローに従います。デコンボリューションの場合は、デコンボリューションソフトウェアでドリフト補正画像を開き、ワークフローに従います。次に、4Dデータを解析し、画像内の定義されたスポットの空間座標を報告することができる後続の画像注釈ソフトウェアでサポートされているファイルタイプでデコンボルブ画像を保存します。
イメージ注釈の場合、イメージ注釈ソフトウェアでデコンボルブされたイメージを開き、3D のすべての時点で分岐のヒントを確認してマークします。イメージ注釈ソフトウェアは、マークされたブランチ ヒントの空間座標と時間座標をレポートし、保存します。後続の計算のために座標情報を CSV ファイルとしてエクスポートします。
スポット モジュールで、[自動作成をスキップして手動で編集する] をクリックし、[選択したスポットに自動接続] チェックボックスをオンにします。時系列のフレームを確認し、注釈の分岐を選択します。Shift キーを押したまま、分岐端子の先端をクリックしてスポットを追加します。
次に、[統計] タブをクリックし、[詳細]、[特定の値]、[位置] を選択します。記録された空間座標と時間座標情報が表示されます。[保存] をクリックして、データを CSV ファイルとしてエクスポートします。
3D で分岐チップの配置を計算するには、CSV ファイルをスプレッドシートとして開き、[トラック ID] 列を選択します。[最小から最大に並べ替え] をクリックし、[選択を展開] を受け入れます。並べ替え後、トラック ID は一意の樹状分岐を識別し、同じ分岐のスポットが同じトラック ID を共有します。
スプレッドシートで[距離]列を追加し、座標を使用して、一時的に隣接する 2 つのスポットの距離を計算します。単一ボクセル レベルでの小さな動きを測定するには、0.3 マイクロメートル未満のすべての距離値をリセットして、補正されていないドリフトまたは不完全な画像注釈をフィルター処理します。次に、変位列を作成し、距離列から変位列に値をコピーします。
各ブランチ ヒントに対して、拡張機能と取り消しイベントを手動で割り当てます。延長の場合は、正の変位値をそのままにします。引き込みである場合は、対応する変位値を負の値に変更します。
次に、新しい Event 列で、個々の延長イベントと退位イベントの変位値を合計します。本ビデオでは、個別に標識された腹側ニューロンの代表から収集された最大強度投影画像系列が観察できる。単一フレームイメージは、取り消しイベントと拡張イベントの評価を可能にします。
分岐端子の半自動4Dトラッキングにより、個別に標識された腹側神経細胞の動的分岐端子のアノテーションを示す。各時点における分岐の動きの方向と距離の計算により、異なる発達段階で個別に標識された腹側ニューロンの樹状枝ダイナミクスを比較することができます。最も重要なステップは、解剖および取り付け中に脳組織および樹状突起形態の完全性を維持することである。
生の画像シリーズの品質は、追跡と定量化を成功させるためにも重要です。この技術を用いて、ショウジョウバエ中枢神経細胞の開発においてデンドライトフィロポディアの定量分析を行い、デンドライト成熟とシナプト発生に関連する分子機械を探索する能力を得た。
