血管形成術は冠状動脈疾患の患者を助けるが、心血管イベントは処置後にまだ起こり得る。PPCと可溶性分子は冠循環から得られるので、血管損傷および修復の程度に相関させることができる。冠動脈MPCおよび可溶性メディターレベルは、冠状動脈形成術を受けている冠動脈疾患患者における心血管性イベントおよび予後を推定するために使用することができる。
Mpcおよび可溶性分子はまた、再発性四肢虚血性脳卒中などの異なる虚血性の設定下で起こる合併症および予後を推定するために使用することができる。この手順のデモンストレーションは、エドゥアルド・ベラ=ゴメスとアレハンドロ・ヘルナンデス=パトリシオ、ラボ技術者、カレン・デ・ラ・ベガ=モレノ、カルロス・サモラ=アレマン、学部生です。また、ガブリエラ・アレクサンドラ・ドミンゲス=ペレス、科学の修士課程の学生、アルベルト・メルチョル・ロペス、博士課程の学生、マリオ・アントニオ・テレス・ゴンザレス、科学の修士の協力者です。
採取から1時間以内に、採取した血液サンプルの6ミリリットルを15ミリリットルの円錐管に移し、PBSで血液を1対1の比率で希釈する。3つの試験管に2ミリリットルの密度勾配媒体を加え、希釈された血液の3つの等しいアリコートを密度勾配媒体の各管に慎重に移す。遠心分離によって細胞を分離し、新しいチューブにインターフェースで細胞を転送します。
採取した細胞をPBSの2ミリリットルで1回6分間洗浄し、続いて1回の新鮮なPBSを2ミリリットルで6回洗浄します。最後の洗浄後、測定用PBSの1ミリリットルにMPC含有細胞ペレットを再び懸濁し、6個の細胞に10回10回加えて5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブを標識した。ペレットは、目的の適切な抗体の100マイクロリットルを遠心分離して、各チューブに抗体インキュベーション溶液で希釈して細胞を添加する。
各追加の抗体カクテルで細胞を10秒間静かに混合し、サンプルを光から保護した摂氏4度で20分間置きます。インキュベーションの終わりに、サンプルを遠心分離し、2ミリモルEDTAを補充したPBSの500マイクロリットルでペレットを再中断する。アイソタイプに一致したコントロールを使用して背景染色を設定し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーでサンプルを分析し、前方散乱プロットのリンパ球をゲージし、残留顆粒球、細胞破片、および他の粒子を除外する。
CD45陽性CD34陽性表現型を持つセルの数が多いゲートを設定します。次に、CD45陽性CD34陽性ゲートを使用して、キナーゼインサートドメイン受容体CD133またはCD184陽性細胞を選択する。MPC サブ集団は、特定のセル表面マーカーによって識別され、ゲート イベントの割合として報告されます。
採取した血液サンプル中の可溶性バイオマーカーの濃度を決定するには、まず、キット提供の洗浄バッファーで適切なプレコーティングされたELISAプレートを2回洗浄し、標準、サンプル、および制御チューブにラベルを付けます。血液サンプルを遠心分離して血液成分を分離し、血漿をサンプルチューブにアリコートする。標準、サンプル、コントロールを適切なウェルに移し、シールを行い、プレートを摂氏37度で90分間インキュベートします。
インキュベーションの終了時に、ウェル内容物を廃棄し、ビオチン検出抗体を各ウェルに添加します。摂氏37度で1時間のインキュベーションを行った後、プレートの内容物を捨て、1回の洗浄バッファーで3回洗浄します。最後の洗浄後、ストレプトアビジンの作業溶液でサンプルを30分間摂氏37度でインキュベートし、次いで3回の洗浄を行います。
最後の洗浄後、テトラメチルベンジジン基板で30分間摂氏37度で処理します。色が現れたら、キットからストップ液を加え、マイクロプレートELISAリーダーで光学密度吸光度を読み取ります。腫瘍壊死因子α、およびインターロイキン-1βの濃度を決定するために、免疫磁気多重法を用いて、標準、サンプル、および対照チューブおよび磁性ビーズバイアルを30秒間制御する。
多重化アッセイプレートの適切なウェルにビーズを追加します。すべてのビーズを追加したら、ハンドヘルド磁気プレートワッシャーをしっかりと挿入し、各ウェルの底にビーズが蓄積するまで2分間待ってから、ハンドヘルド磁気プレートワッシャーとプレートアセンブリの両方を無駄な容器の上に素早く反転させます。次に、各ウェルに150マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、30秒間待ってビーズが底に蓄積できるようにします。
ちょうど示したように、内容を再び廃棄し、ユニバーサルアッセイバッファーの25マイクロリットルと、調製された標準、サンプル、および制御の25マイクロリットルを追加します。プレートを、室温で光から保護し、1分間に500回転を少なくとも60分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、各ウェルに150マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、ビーズを30秒間落ち着かせる。
次に、プレートワッシャーを使用してウェル内容物を廃棄し、25マイクロリットルの検出抗体混合物に続いて2回のスリーチを施したラベルを付けます。2回目の洗浄後、25マイクロリットルのストレプトアビジンPEを室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、各ウェルに120マイクロリットルの読み取りバッファーを加え、室温で光から保護された5分間のインキュベーションのためにプレートを1分間に500回転に密封します。
次に、プレートを多重化アッセイリーダーにロードし、各分析物に従って読み取りパラメータを調整します。冠動脈、便基性線、末梢血は冠動脈造影を受け、高血圧および脂質異常症の高い有病率を示した52人の患者から採取された。ほとんどのMPCのベースライン冠動脈濃度は、主要な有害心血管イベントを発症した患者において有意に低く、MPC亜集団CD34陽性CD133陽性およびCD45陽性、CD34陽性、CD133陽性、CD133陽性、CD184陽性の有意性を有する。
同様に、主要な有害心血管イベントを発症した患者は、可溶性ICAM-1の冠状量のベースラインが増加し、メタロマトリックスタンパク質9の量が少ない。冠動脈PPCおよび可溶性ICAM-1は、主要な有害な心血管無生存のための予後能力を実証した。興味深いことに、腫瘍壊死因子αの発現は、血管内超音波を用いた同じ冠動脈の異なる内腔領域の比較に基づいて、測定時間と冠動脈サンプリングの位置に応じた変動を実証した。
MPCの隔離中は、血液を密度勾配に移し、遠心分離後の界面から細胞を慎重に採取するようにしてください。定期的な渦は、ビーズの沈殿を防ぎ、磁気プレートワッシャーを使用すると、洗濯機の間にビーズをウェル内に保つのに役立ちます。冠状動脈性Mpcおよび可溶性分子は、血管形成術後のフォローアップ中の心血管イベントのリスクを階層化するのに有用であり、この技術は溶液の停止中に起こる病因生理学的プロセスを反映しているので、リスクの高い個体への二次予防の提供を支援し、血管生物学が役割を果たす条件に有用である可能性がある。
