私たちのプロトコルは、研究者が生物の外で冠状動脈性血管新生の分子メカニズムを調査することを可能にするので、重要です。この技術の主な利点は、生物内部の冠状動脈血管新生のプロセスを正確にモデル化し、冠状動脈血管新生のメカニズムの研究を促進することです。胚性11.5日目の胚を70%エタノールで運ぶ妊娠中のマウスをスプレーすることから始めます。
鉗子で腹の上に皮膚を持ち上げ、腹部の皮膚を作るためにはさみを使用し、腹膜切開を横隔膜まで前眼的に子宮の角を露出させる。子宮をつかみ、ティッシュを自由に切り、子宮の角を引き出す。胚のストリングをステレオ顕微鏡下の氷冷滅菌PBSに入れ、各胚から子宮筋、黄身嚢、羊膜カバーを剥がします。
各胚が単離されると、穿張スプーンを使用して、氷の上に滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に組織を移します。胚性心臓組織を収穫するには、顕微鏡下で新しいペトリ皿に解剖される最初の胚を移し、胚を腹側に上に置く。細かい鉗子を使用して、胸部の小さな切開を作り、横隔膜のわずかに上に、そして切開に閉じた鉗子を挿入して切開を拡大する。
胸壁を開けて胸壁を開いたままにして胸壁を開いたままにし、2番目の鉗子を使用して心臓を90度前に静かに動かして、背中大根と静脈を露出させます。次に、心臓の基部でこれらの血管をつかみ、慎重に心臓と肺を前から引き出し、冷たいPBSで組織をすすいだ。すべての心臓組織が採取されたら、心臓サンプルを顕微鏡の下に置き、各心臓から肺葉を取り除きます。
最初の心臓を後側に向け、心臓を基に保持し、細かい鉗子を使用して、心臓からSVを取り囲む隣接する組織の左右の心房を削ります。SVを分離するには、心臓の後側を上方向に向ける。慎重に心臓からSVを除去し、氷の上に氷冷滅菌PBSを含む新しい6センチメートルペトリ皿に単離された組織を配置するために滅菌伝達ピペットを使用しています。
心室全体を分離するには、流出管を取り除き、新しい無菌移動ピペットを使用して、氷の上に氷冷滅菌PBSを含む別の6センチメートルのペトリ皿に心室を置きます。SVと心室全体の培養を設定するには、まず24ウェル培養プレートのウェルあたり1つの8マイクロメートルの孔PET培養インサートの膜をコーティングし、培養1回あたり100マイクロリットルの細胞外マトリックスを37°Cで少なくとも30分間コーティングします。マトリックスが固まったら、移管ピペットを使用して各挿入物に1つの外植物を移し、顕微鏡下でプレートを移動させます。
きれいな鉗子を使用して、各インサートの中央に外植を置いて、それらが側壁に取り付けられていないことを確認し、余分なPBSを慎重に取り除きます。次に、蓋を層流組織培養フードの下に閉じた状態でプレートを移し、各挿入物に100マイクロリットルの事前温め完了培地を加え、各挿入物の下のウェルに200マイクロリットルを加えます。その後、未使用のウェルに300マイクロリットルのPBSを加え、5日間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。
培養2日目のVEGF-A処理では、各培養の両チャンバーから培地を取り出し、各インサートに100マイクロリットルのPBSを加え、各ウェルに200マイクロリットルのPBSを加えます。プレートを数回旋回した後、PBSを1%の牛血清を補充した基底培地の300マイクロリットルに置き換えて培養を開始し、プレートをインキュベーターに戻します。飢餓後3日目に、コントロールウェルと基底培地に300マイクロリットルの新鮮な基底培地と血清を加え、VEGF-Aのミリリットル当たり50ナノグラムを処理井戸に加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。
培養の6日目に、示されているようにPBSでチャンバーを洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒド、各インサートに100マイクロリットルの固定液で培養液を固定します。ロッキングで摂氏4度で20分後、室温で揺れ動かして1回10分間PBSの300マイクロリットルで培養物を洗います。最後の洗浄の後、300マイクロリットルの一次抗体溶液を井戸に加え、ロッキングで摂氏4度で一晩培養します。
翌朝、PBSの非イオン性界面活性剤で培養物を10回洗浄し、10分ごとに洗浄液を交換してから、適切なフルオロフォア共役抗体を一晩で4°Cで2次抗体を結合させた300マイクロリットルで培養液を変化させる。翌日、示すように非イオン性界面活性剤で新鮮なPBSで培養を10回洗浄する。最後の洗浄後、細かい鉗子を使用して各インサートから膜を慎重に剥がし、膜を個々のガラス顕微鏡スライド上に置き、側面を外植します。
カバースリップでDAPI補土媒体でサンプルを覆い、カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。マニキュアが乾燥したら、共焦点顕微鏡でスライドを画像化します。最初のSV細胞が心臓心室に成長するにつれて、彼らはCoup-TF2のような静脈マーカーの産生を停止する。
5日間培養した後、SV内皮細胞が芽を出し、膜上に移動する。胚性心臓と同様に、クープTF2発現は、血管がSVから離れて移動するにつれて減少する。VEGF-Aで刺激された培養物は、密度および長さの両方で血管新生芽の増加の成長を示す。さらに、VEGF-Aによって刺激されたSV培養物は、コントロールと比較して芽長がほぼ3倍に増加することを示し、SVおよび内心からの内皮芽がVEGF-Aに応答することを示唆している。
心臓と肺を引き出し、心房を取り除き、SVを取り巻く隣接する組織を洗浄しながらSV組織を失わないことが重要である。ライブイメージング実験を行い、冠状動脈血管新生を可視化し、その過程で細胞および分子動力学の詳細を捉えることができます。冠状血管新生の潜在的な分子機構を評価する場合や、血管新生全般を研究するためのモデルシステムとして、この技術は極めて有用である。
