心筋症などの新生児疾患では、人工多能性幹細胞由来細胞を用いた再生療法は、大きな可能性を秘めています。しかし、インビトロでの細胞増殖の加速は、活性酸素種などの蓄積代謝産物によるDNA損傷をもたらす。これらのDNA損傷細胞を移植すると、臓器の生着と再生が悪くなります。
移植前に、細胞の品質を評価する必要があります。ここでは、幹細胞のDNA損傷を評価するための2つのステップバイステッププロトコルを提供します。手順を実証するには、研究者のジェシカ・ミラー、研究者のニヒル・マルデカール、ラボ技術者のヴァサンティ・ラジャセカランが行われます。
まず、500ミリグラムの低融解アガロースを100ミリリットルのDNA-RNAフリー水に入れます。アガロースが溶けるまで電子レンジでボトルを加熱します。その後、必要になるまでボトルを摂氏37度の水浴に入れます。
あらかじめコーティングされた彗星スライドを準備するには、ガラススライドに0.5%アガロースの数滴を置きます。すぐにアガロースを広げ、カバースリップを使用してアガロースコーティングの薄い層を形成する。紫外線による細胞損傷を避けるために低光条件下で働き、10マイクロリットルの細胞懸濁液と90マイクロリットルのアガロース溶液をチューブに混ぜます。
アガロースが固化するのを防ぐために、チューブを摂氏37度の水浴に入れます。気泡を導入せずに溶液を混合し、ピペット70マイクロリットルをスポット当たり、プレコーティングされた彗星スライドに入れる。ピペットチップを用いて、細胞アガロース混合物を広げて薄い層を形成する。
スライドを摂氏4度に15分間置きます。容器内で、スライドを冷溶液バッファーに完全に沈めます。容器を暗闇の中に4度摂氏1時間置きます。
溶解バッファーを冷アルカリ溶液に交換してください。スライドが完全に統合されていることを確認します。さらに30分間、4°Cで容器を暗闇の中に残した後、水平電気泳動タンクにスライドを置きます。
スライドが完全に沈むまで冷アルカリ電気泳動バッファーでタンクを充填します。15~30分間、1ボルト/センチメートルで電圧を印加します。容器に、冷たい脱イオン水でスライドを完全に水に浸す。
2分後、脱イオン水を取り出し、新鮮な脱イオン水を加え、このステップをもう一度繰り返します。次に、脱イオン水を冷70%エタノールに交換する。5分後、スライドを傾けずにそっと取り出し、空気を乾燥させます。
乾燥したら、各スポットに100マイクロリットルの希釈DNA染料を加え、室温で15分待ちます。FITCフィルターを使用して、蛍光顕微鏡で、サンプルあたり合計50~100個の彗星の画像を撮影します。テキストプロトコルに記載されている培養iPS由来心筋細胞。
iPS由来の心筋細胞をチャンバースライドで見るために、まず培養培地をウェルから捨て、PBSで細胞を3回洗浄する。ウェルあたり0.25%トリプシンの1ミリリットルを追加し、5分間摂氏37度でインキュベートします。細胞剥離のために顕微鏡の下でプレートを確認してください。
その後、トリプシンを停止するためにCMMの1ミリリットルを追加します。セル懸濁液を15ミリリットルチューブに入れ、遠心分離機を摂氏4度と200倍のgで5分間置きます。培地を捨て、CMMを1ミリリットル加え、細胞を再中断します。
セルを数え、CMMの1.6ミリリットルで200万個の細胞を得るために細胞数を調整します。今8ウェルチャンバースライドの井戸ごとに細胞懸濁液の200マイクロリットルをシード。スライドを軽くタップすると、ウェルの周りに細胞が広がります。
37°Cで細胞をインキュベートします。iPS由来の心筋細胞ドキソルビシン処理では、iPS由来の心筋細胞のウェルから培養培地を捨て、PBSで細胞を洗浄します。1マイクロモルドキソルビシンで細胞を摂氏37度で4時間治療します。
培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄する。免疫標識を行うために、PBSで細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルの新しく調製した4%パラホルムアルデヒドを加えます。室温で暗い中で20分間細胞を固定します。
PBSで細胞を洗浄した後、ウェルあたり200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で加湿したチャンバーに30分間ブロックします。ブロッキングバッファーを取り外し、200マイクロリットルの一次抗体溶液を添加します。室温で暗い加湿室で45分間インキュベートした後、PBSでウェルを3回洗浄します。
PBSを取り除き、2次抗体ミックスの200マイクロリットルを追加します。室温で暗い加湿チャンバーで45分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を3回洗います。
アンチフェードでスライドを取り付ける前に、脱イオン水で洗います。カバーグラスを置き、スライドを暗闇の中で摂氏4度で保管します。共焦点顕微鏡を使用して、サンプルごとにランダムフィールドの画像を3~5枚撮影し、画像解析に進みます。
次に、テキスト プロトコルに示されている手順に従います。画像のパラメータを設定するには、解析対象の画像をファイル リストにドラッグします。入力モジュールで、画像を選択します。
また、入力モジュールでメタデータを選択し、名前と型を選択します。グループの場合は、[いいえ] を選択します。分析モジュールで作業し、色をグレーに選択します。
次に、[スムーズ]を選択し、プライマリ オブジェクトを特定して、もう一度スムーズを選択します。次に、[フィーチャの拡張または抑制] を選択し、[プライマリ オブジェクトの識別] を選択します。解析モジュールで作業を続け、リレート オブジェクトを選択し、オブジェクトを分類して、最後にスプレッドシートにエクスポートを選択します。
左下のパネルで[画像を解析]をクリックして、画像解析を実行します。解析が正常に完了すると、複数の画像が生成されます。CSV ファイルが生成され、コンピューター上の適切な場所に保存されます。
このファイルには、さらなる分析のための定量的データが含まれています。私の実験画像と呼ばれるスプレッドシートでは、列Bは最大5つの切妻を持つ核の数を持ち、列Dは5以上の切り球を持つ核の数を持つことになります。列 B と D を追加して、核の総数を取得します。
すべての画像に対してこれらの手順を繰り返し、すべての分析の前に私の実験ファイル名を変更します。ドキスト処理および非処理iPS細胞からの彗星の代表的な顕微鏡写真をここに示す。iPS細胞にはDNA損傷の基底量が見られ、DNA損傷と尾の瞬間のほんの一部として表された。
しかし、このドキソ処理はiPS細胞のDNA損傷を期待通り増加させ、多能性幹細胞におけるDNA完全性を評価するために彗星アッセイを使用できることを示している。ガンマH2AX免疫標識の代表的な顕微鏡写真は、より低い倍率で、より高い倍率でここに示されている。対照iPS由来心筋細胞では、細胞の90%以上が1核当たり5未満のDDR病巣を有していた。
そして、細胞の合計10%未満は、核あたり6以上のDDR病巣を有していた。6ヶ月間培養したiPS由来の心筋細胞の場合、細胞の90%未満は核あたり最大5つのDDR病巣を有し、合計13%以上の細胞が核1核当たり6つ以上のDDR病巣を有していた。一方、ドキソ処理されたiPS由来の心筋細胞では、80%未満の細胞が核あたり最大5つのDDR病巣を有していた。
そして、細胞の合計約24%が核あたり6以上のDDR病巣を有していた。このデータは、長期にわたるiPS由来の心筋細胞培養およびドキソ治療が著しいDNA損傷を引き起こしたことを示しており、細胞移植には不向きである。これは電気泳動に影響を与える可能性があるため、細胞懸濁液を混合しながら変数を避けることは非常に重要です。
この手順に従って、様々なタイプの細胞を用いて彗星アッセイおよび免疫標識手順を行うことができる。これらの技術は、細胞移植研究に使用される前に、様々な種類の細胞がDNA損傷を評価することを可能にする。
