Recentemente, o papel dos pericítos cerebrais tornou-se evidente em distúrbios neurológicos e função cerebral. Portanto, o desenvolvimento de um método de cultura confiável para essas células é imperativo. Nosso protocolo para a extração de pericítos cerebrais murinas representa uma ferramenta confiável para estudos in vitro e para fornecer pericítes com alta pureza e rendimento celular.
Demonstrando o procedimento com Anupriya Mehra será Lucie Dehouck, uma técnica do meu laboratório. Comece colocando o cérebro de um rato C57BL/6 macho de quatro semanas de idade específico em um limpador seco e estéril e usando fórceps de ponta curva para remover os nervos de cerebelo, estriado e occipital. Use um cotonete para remover todas as meninges visíveis e virar o tecido cerebral de cabeça para baixo.
Abra os lóbulos com traços leves para fora e remova todos os vasos sanguíneos visíveis. Em seguida, coloque o tecido cerebral sem meninges em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 15 mililitros de tampão de lavagem frio B.To homogeneizar o tecido, transferir a amostra cerebral para um tubo de argamassa de moedor de tecido Dounce e adicionar três a quatro mililitros de tampão de lavagem B ao tubo. Use um pilão solto para picar o tecido 55 vezes, depois enxágue o pilão com tampão de lavagem B e pique o chorume de tecido com um pilão apertado 25 vezes.
Ao final da homogeneização, igualmente aliquotar o chorume entre dois tubos de 50 mililitros e adicionar 1,5 vezes o volume de frio 30% bovino serum albumin dextran. Em seguida, agite vigorosamente os tubos para misturar o chorume. Para isolar a fração vascular, sedimentar as células por centrifugação e transferir os supernantes em dois novos tubos.
Armazene a pelota na lavagem do tampão B no gelo. Resuspenda as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem a frio B no gelo. Centrifugar os supernantes colhidos e repetir este passo mais uma vez.
Descarte os supernaciantes e resuspenque as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem B.Em seguida, acumule as pelotas resuspended e leve o volume final da suspensão da célula agrupada para 10 mililitros com tampão de lavagem frio fresco B.Dissociar ainda mais as células com uma pipeta de 10 milímetros seis vezes até que nenhum pedaço restante de pelotas seja visível e use um conjunto de filtro de vácuo e um filtro de malha de nylon para filtrar a suspensão da célula. Coloque o coador em uma placa de Petri e limpe a malha com tampão de lavagem fresco B e raspando para recuperar quaisquer capilares. Em seguida, realize uma segunda filtragem com um filtro fresco.
Divida o filtrado igualmente entre dois tubos e colete as células por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, junte as pelotas em um único tubo contendo tampão de lavagem pré-enwarmed B com enzimas e adicione Colagenase/Dispase pré-enwarmed ao tubo. Coloque o tubo em um banho de água de mesa tremendo por precisamente 33 minutos a 37 graus Celsius antes de parar a reação com 30 mililitros de tampão de lavagem a frio B.Colecione as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o supernante.
Rápido, mas cuidadosamente, ressumem a pelota na lavagem do tampão B seis vezes e centrifufique a suspensão novamente. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota em 18 mililitros de média dMEM completa e sementes dois mililitros de suspensão celular em DMEM completo em nove poços de três placas de seis poços revestidos de Matrigel. Coloque as culturas celulares em uma incubadora estéril de 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes de remover cuidadosamente os detritos de cada poço e adicionar mídia DMEM fresca.
Depois de 48 horas, troque o meio em cada poço a cada 48 horas. No dia 8 a 10, quando as células atingem 100% de confluência, passe as células em meio de cultura pericíte para novas placas de gelatina revestidas de seis poços e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais seis a sete dias com monitoramento. Em seguida, divida as células novamente no dia 17 em pericíte médio em novas placas revestidas de gelatina.
Da passagem zero à segunda passagem, há características morfológicas específicas pelas quais as células endoteliais e o subsequente aumento gradual de pericítos podem ser identificados. Em uma passagem cultura zero, células endoteliais alongadas que se desenvolvem a partir de microvexilhões estão em abundância. Esta abundância é reduzida após a passagem um e ausente após a passagem dois.
Pelo contrário, os pericílitos aparecem como raras células quadrilaterais nas culturas primitivas e se tornam abundantes pela segunda passagem. A avaliação da expressão de NG2, CD146 e PDGFR beta pode ser usada para avaliar a pureza da cultura pericíte por PCR quantitativo, imunocitoquímica e mancha ocidental. A digestão enzimápica é um passo crítico para o sucesso do protocolo.
Certifique-se de monitorar rigorosamente as concentrações enzimáticas e o tempo de incubação.
