Récemment, le rôle des péricytes cérébraux est devenu évident dans les troubles neurologiques et la fonction cérébrale. Par conséquent, le développement d’une méthode de culture fiable pour ces cellules est impératif. Notre protocole pour l’extraction des péricytes cérébraux murins représente un outil fiable pour des études in vitro et pour fournir des péricytes avec la pureté élevée et le rendement cellulaire.
Lucie Dehouck, technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec Anupriya Mehra. Commencez par placer le cerveau à partir d’une souris C57BL/6 mâle spécifique exempte d’agents pathogènes de quatre à six semaines sur un lingette stérile sans peluches sèches et en utilisant des forceps incurvés pour enlever le cervelet, le striatum et les nerfs occipital. Utilisez un coton-tige pour enlever toutes les méninges visibles et retourner le tissu cérébral à l’envers.
Ouvrez les lobes avec de légers coups vers l’extérieur et retirez tous les vaisseaux sanguins visibles. Ensuite, placez le tissu cérébral sans méninges dans une boîte petri de 100 millimètres contenant 15 millilitres de tampon de lavage à froid B.To homogénéisez le tissu, transférez l’échantillon de cerveau dans un tube de mortier de broyeur de tissu de Dounce et ajoutez trois à quatre millilitres de tampon de lavage B au tube. Utilisez un pilon lâche pour hacher le tissu 55 fois, puis rincez le pilon avec le tampon de lavage B et hacher le lisier de tissu avec un pilon serré 25 fois.
À la fin de l’homogénéisation, aliquot également la boue entre deux tubes de 50 millilitres et ajouter 1,5 fois le volume de froid 30% bovin sérum albumine dextran. Ensuite, secouez vigoureusement les tubes pour mélanger le lisier. Pour isoler la fraction vasculaire, sédimenter les cellules par centrifugation et transférer les supernatants dans deux nouveaux tubes.
Conserver la pastille dans le tampon de lavage B sur la glace. Resuspendez les granulés en trois millilitres de tampon de lavage à froid B sur la glace. Centrifugez les supernatants récoltés et répétez cette étape une fois de plus.
Jeter les supernatants et resuspendre les granulés en trois millilitres de tampon de lavage B.Puis mettre en commun les granulés résuspendus et porter le volume final de la suspension cellulaire mise en commun à 10 millilitres avec tampon de lavage à froid frais B.En outre dissocier les cellules avec une pipette de 10 millimètres six fois jusqu’à ce qu’aucune touffe restante de granulés sont visibles et utiliser un assemblage de filtre à vide et une passoire en nylon maille pour filtrer la suspension cellulaire. Placer la passoire dans une boîte de Pétri et dégager le maillage avec le tampon de lavage frais B et racler pour récupérer les capillaires. Ensuite, effectuez une deuxième filtration avec un filtre frais.
Répartir le filtrate également entre deux tubes et recueillir les cellules par centrifugation. Après avoir jeté les supernatants, mettre les granulés en un seul tube contenant le tampon de lavage préchauré B avec des enzymes et ajouter de la collagène/dispase préchaurée au tube. Placez le tube dans un bain d’eau de table secouant pendant exactement 33 minutes à 37 degrés Celsius avant d’arrêter la réaction avec 30 millilitres de tampon de lavage à froid B.Recueillir les cellules par centrifugation et jeter soigneusement le supernatant.
Dépensez rapidement mais soigneusement la pastille dans le tampon de lavage B six fois et centrifugez à nouveau la suspension. Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille en 18 millilitres de milieu DMEM complet et grainez deux millilitres de suspension cellulaire dans le DMEM complet dans neuf puits de trois plaques de six puits recouvertes de Matrigel. Placez les cultures cellulaires dans un incubateur stérile de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant 24 heures avant d’enlever soigneusement les débris de chaque puits et d’ajouter des supports DMEM frais.
Après 48 heures, changer le milieu dans chaque puits toutes les 48 heures. Le jour huit à 10 lorsque les cellules atteignent 100% confluent, passer les cellules dans le milieu de culture péricyte sur de nouvelles plaques gélatincées de six puits et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de six à sept jours avec la surveillance. Ensuite, divisez à nouveau les cellules le jour 17 dans le milieu péricyte en nouvelles plaques enduites de gélatine.
Du passage zéro au passage deux, il existe des caractéristiques morphologiques spécifiques par lesquelles les cellules endothéliales et l’augmentation progressive subséquente des péricytes peuvent être identifiées. Dans une culture de passage zéro, les cellules endothéliales allongées qui se développent à partir de microvételles sont en abondance. Cette abondance est réduite après le passage un et absente après le passage deux.
Au contraire, les péricytes apparaissent comme des cellules quadrilatérales rares dans les premières cultures et deviennent abondants par le passage deux. L’évaluation de l’expression de NG2, CD146, et bêta de PDGFR peut être employée pour évaluer la pureté de la culture de péricyte par PCR quantitatif, immunocytochimie, et tache occidentale. La digestion enzymatique est une étape critique pour le succès du protocole.
Assurez-vous de surveiller strictement les concentrations d’enzymes et le temps d’incubation.
