В последнее время роль перицитов головного мозга стала очевидной в неврологических расстройствах и функции мозга. Поэтому разработка надежного метода культуры для этих клеток является императивом. Наш протокол по извлечению муриных мозговых перицитов представляет собой надежный инструмент для исследований in vitro и для обеспечения перицитов с высокой чистотой и выходом клеток.
Демонстрацией процедуры с Антуприей Мехрой будет Люси Дехук, техник из моей лаборатории. Начните с размещения мозга из конкретных патогенов, свободных от четырех до шести недель мужской C57BL/6 мыши на стерильные сухие ворсинки свободной салфетки и с помощью изогнутых миппов кончика для удаления мозжечка, striatum и затылочной нервов. Используйте ватный тампон, чтобы удалить все видимые оверинги и перевернуть ткани мозга с ног на голову.
Откройте доли легкими внешними штрихами и удалите все видимые кровеносные сосуды. Затем поместите менинги свободной ткани мозга в 100 миллиметров Петри блюдо, содержащее 15 миллилитров холодного стирального буфера B.To гомогенизировать ткани, передать образец мозга в Dounce ткани шлифовальной минометной трубки и добавить три-четыре миллилитров стирального буфера B в трубку. Используйте свободный пестик, чтобы фарш ткани 55 раз, а затем промыть пестик с стиральным буфером B и фарш ткани суспензии с жесткой пестик 25 раз.
В конце гомогенизации, в равной степени aliquot суспензии между двумя 50 миллилитров труб и добавить в 1,5 раза объем холодной 30%бычьей сыворотки альбумин декстран. Затем энергично встряхнуть трубки, чтобы смешать суспензию. Чтобы изолировать сосудистую фракцию, отложения клеток центрифугации и передачи супернатантов в две новые трубы.
Храните гранулы в стиральном буфере B на льду. Повторное производство гранул в трех миллилитров холодного мытья буфера B на льду. Центрифугайте собранные супернатанты и повторите этот шаг еще раз.
Отбросьте supernatants и resuspend гранулы в 3 миллилитров стирального буфера B.Then бассеин resuspended гранулы и принесите окончательный том слитков клетки к 10 миллилитров с свежим холодным буфером мытья B.Further dissociate клетки с пипеткой 10 миллиметров 6 времен до тех пор пока никакие остальные clumps гранул не будут видимы и не использовать вакуумную сборку фильтра. Поместите ситечко в чашку Петри и очистить сетку со свежим буфером стирки B и соскабливания, чтобы восстановить любые капилляры. Затем выполните вторую фильтрацию со свежим фильтром.
Разделите фильтрат поровну между двумя трубками и соберите клетки путем центрифугации. После отбрасывания супернатантов, объединить гранулы в одну трубку, содержащую довоенный стиральный буфер B с ферментами и добавить предварительной коллагеназы / dispase в трубку. Поместите трубку в трясущимся столом водяной бане в течение ровно 33 минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем остановить реакцию с помощью 30 миллилитров холодного стирального буфера B.Collect клетки центрифугации и тщательно отбросить супернатант.
Быстро, но тщательно повторно гранулы в стиральный буфер B шесть раз и центрифуга подвески снова. После отказа от супернатанта, повторно гранулы в 18 миллилитров полного DMEM среды и семян двух миллилитров клеточной подвески в полном DMEM в девяти скважинах из трех Matrigel покрытием шесть скважин пластин. Поместите клеточные культуры в стерильный 37 градусов по Цельсию 5%углекислый газ инкубатор в течение 24 часов, прежде чем тщательно удалить мусор из каждой хорошо и добавить свежие СРЕДСТВА массовой информации DMEM.
После 48 часов, изменение среды в каждом хорошо каждые 48 часов. На 8-10 день, когда клетки достигают 100% слияния, прохождение клеток в перицитовой среде культуры на новые желатин покрытием шести-хорошо пластин и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры в течение дополнительных шести-семи дней с мониторингом. Затем разделить клетки снова на день 17 в перицитовой среде на новые пластины с покрытием желатина.
От нулевого прохода к проходу два, Существуют конкретные морфологические характеристики, с помощью которых эндотелиальные клетки и последующее постепенное увеличение перицитов могут быть определены. В проходе нулевой культуры, удлиненные эндотелиальные клетки, развивающиеся из микровесселей в изобилии. Это обилие уменьшается после прохождения одного и отсутствует после прохождения два.
Напротив, перициты появляются как редкие четырехсторонние клетки в ранних культурах и становятся обильными путем прохождения два. Оценка экспрессии NG2, CD146 и бета-версии PDGFR может быть использована для оценки чистоты перицитной культуры с помощью количественных ПЦР, иммуноцитохимии и западной помарки. Переваривание ферментов является важным шагом для успеха протокола.
Обязательно строго следите за концентрацией ферментов и временем инкубации.
