このプロトコルは、生体内の他のプロセスからの干渉を防ぎながら、高周波/高振幅電流注入後の神経ブロックキャリーオーバーなど、よく理解されていない多くの神経生理学的現象の観察を可能にします。この技術は、再現性が高く堅牢な結果をもたらし、麻酔の深さなどの複雑な変数を制御する必要はなく、したがって測定に影響を与えることができないため、in vivo電気生理学よりも実用的です。麻酔下での安楽死後、雌ラットを解剖台の上に置き、足首を親指、人差し指、中指でしっかりと保持し、12センチのまっすぐな鈍いはさみで踵骨腱を切断します。
細かい鉗子とはさみを使って、坐骨神経が露出するまで、脚の後ろの中央付近の筋肉層を通して慎重に切開します。神経が見えたら、氷冷修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液(MKHB)を使用して空洞に潤いを与え、神経が乾燥するのを防ぎます。止血剤を使用して、両側の皮膚のフラップを引っ張り、より細かい解剖のために切開部を開いたままにします。
踵骨腱切開位置から始めて、細かいはさみを使用して、脚の内側の筋肉を中断して神経を解放します。氷のように冷たいMKHBで地域の水分レベルを維持し続けます。脚を上に動かしながら神経が露出したので、その上にある筋肉組織を解剖します。
脊椎に近い神経を結合組織から脊椎間隙に到達するまで解放し、その時点で神経にねじれがある。この段階ではスピードが不可欠であるため、まだ神経をきれいにしないでください。解剖を容易にするために、鉗子を使用して、足首の近くの神経の端を静かに引っ張ります。
その後、細かいはさみを用いて、脊椎に近い神経を重症化する。解剖した神経をMKHBで満たされた15ミリリットルの遠心チューブに入れ、洗浄手順の開始までチューブを氷の上に戻します。コーティングされたペトリ皿を冷やした酸素化MKHBで半分満たし、解剖した坐骨神経を皿に入れ、神経の両端を皿に固定して、神経がねじれ、ねじれ、ねじれのないまっすぐになるようにします。
6-0シルク縫合糸または細い糸を使用して、神経の両端の周りに二重の結び目を結び、緩衝液への細胞質ゾルの漏れを防ぎます。神経組織から緩衝液への漏れを防ぐために、神経の中心に近い側の昆虫ピンのすぐ隣に結び目を置きます。顕微鏡下で、2ミリメートルの角度を付けたスプリングはさみと細かい鉗子を使用して、神経から脂肪、血管、筋肉組織を取り除きます。
刺激や記録に使用されない神経枝を剪定します。洗浄の5分ごとに、バッファーを新鮮な、冷やされた酸素化されたMKHBと交換してください。洗浄後、神経を緩衝液で満たされた輸送チューブに戻して、チューブを氷の上に置きます。
清潔な両室の神経浴を準備します。標準的な実験室のボスヘッドとグリッパーを使用して、神経浴を加熱攪拌機に置かれた2リットルのボトルのレベルの下に置きます。バスのドレンをペリスタルティックポンプの入口に接続します。
ペリスタルティックポンプの出口をバッファボトルに戻るチューブに接続します。バスインレットを調整可能な流量バルブでチューブに接続し、チューブをボトル内に入れます。中央の出口に接続されたシリンジを備えた三方弁を使用して、重力支援バッファー流入用のサイフォンとしてチューブをプライミングするのに役立ちます。
バッファがシリンジに流れるまでシリンジを引き抜いてサイフォンをプライムします。浴へのバッファ流量が毎分5〜6ミリメートルになるようにバルブを構成します。流量は、最初に浴を満たすために増加させることができる。
浴槽の緩衝レベルが排水管に達したら、神経を風呂に入れます。昆虫ピンを使用して、神経の端をバッファーで満たされた浴室の角に固定します。45度の角度の細かい鉗子を使用し、両端のみで神経をつまみ、2つの浴室の間の仕切りの穴を通して刺激される神経を慎重にねじ込みます。
昆虫ピンを使用して、神経の他端を風呂の油室に固定し、神経が引き伸ばされずにまっすぐで、ねじれやねじれがないことを確認します。シリコーングリースを使用して、バッファーチャンバーからオイルチャンバーへのバッファー漏れを防ぐためにシールを作ります オイルチャンバーをシリコーンまたは鉱物油で満たします。銀/塩化銀記録電極フックをオイルバスチャンバーに置き、ボスヘッドとグリッパーで固定します。
次に、神経を引き締めることなく、オイルバス内の神経の部分をフックの上にドレープします。神経を動かした後に漏れが観察された場合は、シリコーングリースシールを調整または修復してください。基準銀/塩化銀電極をアンプのグランドに接続し、電極をバッファーで満たされた浴室に、実験室用グリッパーを使用して固定して配置します。
刺激のためにきれいな神経カフ電極を調製した後、電極を緩衝液充填浴室に置く。先端が鈍い、または角度のある鉗子または細かいピンセットを使用して、バス内の電極を開き、袖口の内側を濡らします。泡が残っている場合は、細かい注射器を使用して浴からバッファーを引き出し、泡を袖口から強制的に取り出します。
ピンセットを使用して、袖口を静かに開き、神経の下にスライドさせます。神経の周りの袖口を閉じ、神経のねじれやねじれを避けます。刺激電極と電流戻し電極を刺激装置に接続します。
電流リターン電着として正方形の白金シートを使用する場合は、お風呂の中で神経から離れてシートを置きます。両方の電極のリード線をテープで固定します。スティミュレータTTL信号出力をオシロスコープのチャンネル4に接続します。
オシロスコープ画面で、[トリガチャンネル]タブを押し、トリガチャンネルとしてチャンネル4を指定します。レベルノブを使用してトリガーレベルを1ボルトに設定します。オシロスコープで、時間分解能を分割あたり1ミリ秒、電圧分解能を1分割あたり10ミリボルトに設定します。
トリガリファレンスを時間内にセンタリングし、トリガレベルを1ボルトに設定します。刺激装置をコンピュータに接続した後、バッテリ電源を電源入力に接続して、刺激装置の電源を入れます。次に、コンピューターで MATLAB ソフトウェアを起動します。
カスタム MATLAB スクリプトを実行します。次に、示された MATLAB スクリプトを開きます。スクリプトを編集し、パラメータ刺激器パルス振幅をマイナス300マイクロアンペア、刺激器パルス幅を300マイクロ秒、刺激器パルス数を10、刺激器パルス間時間を1秒に設定します。
ソフトウェアで[実行]をクリックして刺激プロトコルを開始します。化合物活動電位(CAP)は、電極で1ミリボルト、増幅時に100ミリボルトのピークツーピーク振幅を有していた。標準的なプラチナ神経袖口およびカスタムメイドの導電性エラストマー神経袖口の典型的な神経興奮性がここに示されている。
両方の坐骨神経を用いた実験の1日にわたってエキソビボで得られたCAPをここに示す。最小のCAP振幅減少は、右坐骨神経で観察された。対照的に、約3ミリボルトの左坐骨神経CAP振幅は、神経抽出後6時間以上経過した実験開始時の右坐骨神経の振幅と類似していた。
解剖、洗浄、および実装技術における精度と再現性を重視する。お風呂で何が起こっているのかに注意してください。神経信号が失われた場合、それは単に電極が良好に接触していないか、またはバスオイル仕切りに生理食塩水があることであり、神経が死んでいることではない。
初めてのユーザーは、特に解剖段階では、急いでいるように誘惑されるかもしれません。これはおそらく間違いにつながり、神経を傷つけるでしょう。ここでは精度と一貫性が重要であり、より高品質の結果につながります。
バッファー調製の一貫性にも特別な注意を払う必要があります。
