チャネルロドプシン支援回路マッピングは、長距離ニューラルプロジェクションの機能的マッピングの精密技術です。ここでは、このアプローチを用い、聴覚脳幹の回路を調べる方法を示す。脳のスライスでは、複数のソースからの軸索がしばしば混合され、電気刺激を用いて個々の入力を分離することが困難である。
CRACM を使用することで、この制限を克服できます。ラムダを見つけ、ステレオタックス座標系を一貫して定義することは、手順の持続時間を短く保つことと同様に困難です。すべてのステップを慎重にマッピングすると、成功率が向上します。
手術領域を覆うために70%エタノールを散布し、滅菌タオルドレープを設置します。ケージ寝具を取り外して、回復ケージから窒息のリスクを抑えます。次に、ケージの下に加熱パッドを入れ、食料と水源を提供する。
次に、動物を立体性フレームに移し、麻酔を続ける。直腸温度プローブを挿入し、恒常性温度コントローラのスイッチをオンにします。次に眼の軟膏を塗布して、眼が乾燥するのを防ぎます。
先制性鎮痛薬を投与する。最後に、電気バリカンで頭皮を剃ります。ポビトンヨウ素と70%エタノールの3つの交互の綿棒で頭皮を消毒します。
中線に沿って頭皮を切開し、耳の間から目にrostralを続け、ラムダとブレグマ縫合糸を露出させることで手術を開始します。皮膚を横に押し付け、必要に応じて露出した骨から骨膜を取り除きます。次に、ラムダ縫合糸を外科用マーカーでマークし、ナノインジェクターの先端をλに触れ、マイクロマニピュレーター座標をゼロにするようにします。
ナノインジェクターチップとマイクロマニピュレータを使用して、ラムダとブレグマ縫合糸の標高の差を測定します。パレットバーの高さを調整して、ラムダとブレグマをプラスマイナス100マイクロメートルの高さの差にします。ナノインジェクターチップとマイクロマニピュレーター座標系を使用して注射部位をマッピングし、外科マーカーでサイトをマークします。
次に、0.5ミリドリルバリを備えたマイクロモータードリルを使用して、注射部位の開頭術を行います。標的核内のニューロンの広範なトランスフェクションを確実にするために、ナノインジェクターを使用して組織の様々な深さで注射を行い、より大きな脳領域の場合は、劣ったコリカルのような、異なるX座標とY座標で2つ以上の浸透の過程で注射を行う。下のコリキュラスを注入するには、2,250マイクロメートルと1,750マイクロメートルの深さの間のZ軸に沿って250マイクロメートルの間隔で20ナノリットルのウイルスを沈着させる。
後部人工内核に注射する場合、それぞれ4、750マイクロメートル、4、550マイクロメートルの深さで20ナノリットルのウイルスを堆積させる。各Z座標で注入した後、注入器を次のZ座標に移動させる前に2〜3分待って、ウイルスが注入部位から拡散する時間を与え、ナノインジェクターが再配置されたときにウイルスが注入路を吸い上げられる可能性を減らします。その後、最後の注射の後、脳からナノインジェクターを引き込む前に3〜5分待ちます。
ナノインジェクターが脳から浸透し、動物間で除去された場合、先端から少量のウイルスを排出して、先端が詰まっていないかどうかを確認します。注射後、無菌PBSを使用して頭皮のカットエッジを濡らし、皮膚を中線に向かって静かに戻します。6-0ナイロン縫合糸を使用して、単純な中断縫合糸で傷口を閉じます。
次いで、創傷に0.5を2%リドカインゼリーの1ミリリットルに塗布する。イヤーバーと温度プローブを取り外し、イオフルランを回し、パレットバーから動物を取り出し、回収ケージに移します。最後に、リカバリを注意深く監視します。
動物が完全に目を覚まし、動き回り、痛みや苦痛の兆候を示さないと、ケージに戻してケージをビバリウムに戻します。録音するには、標準パッチクランプ方式を使用します。固定段階の直立顕微鏡の下で記録チャンバーにスライスを置き、1分間に2ミリリットルで人工脳脊髄液で絶えず多量に過ごします。
次に、適切なパッチクランプアンプを用いて、視覚制御下のパッチニューロンを用いる。最後に、卸売録画中に、市販のLEDを介して580ナノメートル光の短いパルスで470ナノメートル光またはChrimsonRの短いパルスを提供することによってクロノスを活性化します。結果は、ChrimsonR注射が細胞および繊維に見えるtdTomato蛍光を有するDCNにおいて強い発現につながったことを示した。
反側ICCでは、tdTomatoで強く標識された繊維が3週間後にはっきりと見え、聴覚脳幹核に注入された際のChrimsonR-tdTomato構造の長距離人身売買能力を実証した。IC VIPニューロンにおけるChrimsonRの発光EEPSの光学的活性化は、実験パラメータが青色光の代わりに赤色光の使用を要求する場合に、ChrimsonRが長距離CRACM実験に有用なツールであることを示す。しかし、ChrimsonRは青色光で容易に活性化され、クロノスと同じ青色光活性化の閾値を示すことがわかりました。
このプロトコルでは、ステレオタキシック座標が正しいことを確認し、ウイルスが標的とする脳領域でのみ発現していることを確認することが最も重要です。クロノスChrimsonRウイルスを別のウイルス、例えば細胞特異的なFlexウイルスと交換することによって、手術プロトコルを変更することなく、いくつかの解剖学的または生理学的な質問に答えることができます。
