P.ベリザー、J.ヨハンセンH.、オクラの抗体、A.デベック、ブルーミントン、ウィーンのハエストックセンターに感謝します。提案と刺激的な議論のためのC.ジャクソンに感謝します。

1. ショウジョウバエ精巣コレクション
注:若い男性(0-15時間後-分浸)は、ジロイド生殖細胞(すなわち、精子および精子細胞)を調べるのに必要である。
<ol><li>精子の開発による干渉を最小限に抑えるために、可能な限り若いハエを選択してください。</li>
	<li>二酸化炭素への短時間の暴露によってハエを麻酔し、フライパッド14、15に移す。</li>
	<li>解剖顕微鏡(10倍の倍率)の下で、鉗子を使用して頭部を取り除く。</li>
	<li>5~10個の切断されたハエを、黒いバックグラウンドサポート上のシリコーンコーティングされたガラススライド上のリンゲルのバッファー(183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完全タンパク質阻害剤、pH 6.8)の100 μLに移します。</li>
	<li>40倍の倍率で顕微鏡を解剖すると、5個の鉗子を1組使って胸部と腹部の間にハエを保持し、他の鉗子で腹部を胸郭から引き離します。精巣と隣接組織をハエ・カーカス15から迅速に分離し、同じスライド上のリンガーの緩衝液の新しい滴に入れる。</li>
	<li>すべての精巣の準備ができたら、残りの組織(補助腺と外部生殖器)から精巣をきれいにします。</li>
	<li>解剖された精巣を含むドロップから余分なバッファを取り除きます。通常、200 μL チップの上に 10 μL チップを取り付けた p200 ピペットを使用します。これは小さい絞りを通して液体過剰の除去を可能にする。解剖精巣を含むドロップの上に4%パラホルムアルデヒド固定液の滴を置き、次いで迅速に新しい固定溶液を含むチューブに精巣を移します。</li>
</ol>2. パラホルムアルデヒド固定
<ol><li>使用直前に2 mLの固定液を調製:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した4%パラホルムアルデヒド600 μL、NP40 20%の30 μL+2 mLシリコン化マイクロ遠心チューブ内のヘプタン1200 μLを使用します。600 μL アリコートで調製し、-20°Cで保存した PBS で 4% パラホルムアルデヒドを使用してください。 注意: ヘプタンとパラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードで扱う必要があります。ホスト協会の規則に従って処分する。</li>
	<li>広い開口チップを備えたp200マイクロピペットを使用して、PFA/NP40/ヘプタン溶液に精巣を移します。チューブを上下に振って30s手で動かします。室温で30分間、回転ミキサーで精巣を固定し続けます。</li>
	<li>回転ミキサーを停止し、チューブラックにチューブを置いて、相分離を可能にし、精巣がチューブの底部に落ち着くようにします。</li>
	<li>すべてのヘプタンと固定溶液を取り除き、1x PBSで3回素早く精巣をすすぐ。</li>
	<li>きれいな200 μLの個々の管に移す。これらの小さなチューブ内のすべてのインキュベーションを行い、抗体の使用量を最小限に抑えます。</li>
	<li>P200とP10チップの両方を取り付けた200 μLマイクロピペットを使用して余分なバッファーを除去します。精巣を吸引しないように注意してください。</li>
	<li>すべてのサンプルが準備ができるまで氷の上に1x PBSで精巣を保ちます。</li>
</ol>3. 溶液中の抗体染色
<ol><li>PBSを廃棄し、細胞膜を透過させるために室温で30分間0.3%PBS-Tに精巣を残します。</li>
	<li>同じバッファーに 5% 通常のヤギ血清 (NGS) を加えた 1 時間の前培養します。</li>
	<li>0.3%PBS-Tプラス5%NGS(材料表)に希釈された一次抗体の200 μLを加える。</li>
	<li>ロッカーに緩やかな攪拌を伴い、一次抗体を4°C(または室温)で一晩インキュベートします。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで3回洗浄します。重力によって精巣がチューブの底に落ち着くようにします。</li>
	<li>DyLightコンジュゲートシリーズから1:500希釈した二次抗体200μLを加えます。</li>
	<li>二次抗体を暗室で室温で4時間インキュベートする。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで洗います。その後、0.2%PBS-Tと0.1%PBS-Tで繰り返し、室温でロッカーで30分間繰り返します。洗剤を取り除くために30分間、PBS1xで最後の洗浄を行います。</li>
	<li>1μg/mLのDAPI溶液を1μg/mLで1x PBSで15分間追加します。ストック溶液はH2Oで10mg/mLであり、PBSでストック溶液を作ることを避け、より大きな精子での拡散クロマチンのDAPI染色信号を減少させることができます。</li>
	<li>3倍の洗剤を5分間洗います。</li>
	<li>疎水性バリアペンを使用して、きれいなスライドに円を描きます。</li>
	<li>試験を吸引し、スライドの上に置きます。広い開口チップを0.1%PBS-Tでプレリンスすると、精巣が先端に付着するのを防ぎます。余分なPBSを除去します。</li>
	<li>シティフルオールAF1のドロップ(約100 μL)を加えます。</li>
	<li>ガラスのカバースリップを組織の上にそっと置き、気泡をトラップしないように注意してください。</li>
	<li>クリアマニキュアを使用して、カバースリップをスライドに密封します。</li>
	<li>顕微鏡でスライドを観察します。</li>
</ol>4. 共局化分析
<ol><li>共焦点画像を取得します。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡(63xプランアポクロマティックオイル)を使用し、Z解像度は0.5または1μmでした。</li>
	<li>独立した精巣から異なるセルを選択します。</li>
	<li>処理ソフトウェア(例えば、イマリス)に画像をインポートします。</li>
	<li>隣接する核を除外するために、手動セグメンテーションで核を定義します。Coloc ソフトウェアを使用する。2つのフルオロフォア間の全容内でピアソンの相関係数(PCC)を収集します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、成体成群ショウジョウバエ精巣の免疫標識を成功させるための方法を提供する。他の手順で報告されているように、若い男性は精子を妨害する危険性のある精子の発症の存在を最小限に抑えるために使用する必要があります(我々も、発疹後20時間以内に年齢を短縮しました)。解剖は迅速で、抗体希釈はシグナル対ノイズ比21、22、23を最適化するように調整する必要があります。他のプロトコルを用いるため、精巣の深さ全体に染色を観察せず、NP40やヘプタンとPFAを組み合わせた固定法を開発しました。現在では、20%NP40の30 μLと2巻のヘプタンを用いたPBSで、4%パラホルムアルデヒド600 μLを日常的に使用しています。これは、十分な透過性を可能にするために重要です。NP40の量を10 μLに減らすことによって、目に見えてラベル付けを減らすことができます。その後のステップはすべて懸濁液で行い、精巣が重力によって管の底に穏やかに降下できるようにすることで余分な緩衝液を除去した。サンプルをスライドに移す最後のステップでは、0.1%PBS-Tでチップをすすいで、精巣が円錐に付着するのを防ぎます。観察によると、免疫組織学的染色プロトコルは、ここで使用されるマーカーを含む様々な核タンパク質、ならびにエピジェネティックヒストン修飾、ラミンおよびヌクレオポリンのプローブとうまく機能する。このプロトコルは幼虫精巣にも使用でき、その場合はヘプタンを省略する必要があります。
このプロトコルは、精巣の効率的で均一な標識のために、精子細胞の損傷のないスタックを一緒に維持するように特に設計されています。我々は、その不整形核が保存するのが最も困難な細胞の中でそれらを作る大きな後期精子細胞とプロトコルを示した。さらに、これらの精子細胞では核標識が核の大きさのために希薄化することが多い。例えば、DAPIまたはラミン標識が精巣の頂点で細胞内で強く、精子が3,24に成長するにつれて徐々に弱くなり、より分散することが一般的に観察される。これはまた、ヌクレオポリンの分布が初期段階の細胞(精子および初期の精子細胞)17にしか記載されていない理由の1つである可能性がある。
ショウジョウバエS5精子細胞の免疫染色の優れた画像が公開されており、特に精巣特異的t-BRDおよびdanyタンパク質25、26は、0.3%デオキシコール酸ナトリウムプロトコルを用いて、または組織21,22のスカッシュに続く。私たちの手の中では、スカッシュは臓器の深部の染色の有意な不均一性をもたらし、3D構造を犠牲にします。0.3%のデオキシコール酸ナトリウムを使用しても、より良い結果を得たとしても、我々はまだ不均一性を観察した。したがって、再現性とラベルの品質のためにNP40を好みます。共焦点画像は核タンパク質の3D画像の再構成を可能にする。例えば、我々は、この方法を、非染色体クロマチン質量と核細孔ネットワークと密接に関連する核内MINTドメインによってここに示される多くの異なるプローブを用いてうまく適用した。これらの精子細胞核の核毛の興味深い3D分布は、さらなる研究のために利用可能になりました。画像は同じ精巣および異なった精巣からの異なった精子からの共局在化の再現可能な定量を可能にする。私たちの知る限りでは、ピアソン相関係数による正確な定量がこのようなサンプルで測定されたのは初めてです。それは異なった精巣の正確な免疫標識蛋白質のレベルの比較のために必要な信頼を与える。

ショウジョウバエの精巣は、核建築の研究にとって貴重なモデルです。有糸精子細胞では、核体積は主にクロマチンによって占められます。これらの細胞は4ラウンドの分裂を受け、16の原発性精子細胞の嚢胞を産生する。次の数日間にわたって、精子細胞は6つの発達段階(S1-S6)を通過し、体積が大幅に増加し、およそ20倍1、2。彼らはまた、核形態を変えます。ラミンDm0によって明らかにされた核の輪郭は不規則になり、深い内層1、3を示す。これは、クロマチン組織1、4、5、6、7における広範な遺伝子発現変化および修飾を伴う。この相間染色体は、ステージS4-S5で明確に定義されており、2つの主要な二価オートソームと核子とドッキングされたX-Y対に対応する3つの異なる質量を形成する。
Mad1 はもともと、有糸分裂性チェックポイントの重要な構成要素として分離されました(8でレビュー)。相間では、核エンベロープに位置するが、核内に位置する9、10、11と記載されている。ショウジョウバエ精巣では、Mad1が核内で顕著であり、2つの主要な常染色体塊と密接に関連しており、XYクロマチンとのより少ない程度に関連していると報告した。我々は、このクロマチン関連構造をMINT(Mad1含有核内領域)12と定義した。他の4つのタンパク質は、精子細胞におけるMINTと関連していた:ヌクレオポリンMtor/Tpr、SUMOペプチダーゼウルプ1、有糸性チェックポイントタンパク質Mad2およびポリコーム様複合体Raf212のサブユニット。
MINTの説明を完了するために、我々は抗体を使用する必要があり、精巣における免疫染色に一般的に遭遇する技術的な問題に直面していた:透過性が悪く、特に大きな精子で精巣の深部に有意な不均一性の染色をもたらした。Squashed製剤は抗体アクセスを増加させたが、圧縮画像、3D分析を制限し、共局在化を含む定量的蛍光の測定を妨げる。抗体の浸透の問題は、0.3%Naデオキシコール酸13などの透過性剤によっても対処することができたが、この手順は我々の手の中に再現可能な結果を生み出さなかった。多くの共標識実験を行ったため、パーメバライゼーションプロトコルの改善を検討しました。1%NP40とヘプタンの組み合わせは、特に大きな精子細胞を研究する上で、より再現性をもたらした。
このプロトコルは、懸濁液中の精巣の固定および免疫染色を行い、サンプルの品質を向上させ、再現性を高め、共焦点顕微鏡に適したレンダリングを行います。我々は、このプロトコルを用いて、特定の核エンベロープタンパク質と大きな精子細胞の核内構造の空間的関係をより良く定義した。この方法は、例えばクロマチン、核細胞および核の毛穴を含む核の動的構造変化など、精子細胞の発達に伴う変化のより良い調査を可能にする。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Drosophila srains&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&amp;nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>Vienna Drosophila RNAi Center</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>Stock solution must be prepared in H2O</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP Wide Bore Pipette Tips</td><td>Fisherbrand</td><td>11917744</td><td>Wide aperture tip</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;0.2 mL Individual Tube</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml micro centrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA&amp;nbsp;</td><td>Siliconized 2ml tube</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4%</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G&amp;nbsp;</td><td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&amp;nbsp;; aliquot by 600 ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td></tr><tr><td>0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&amp;nbsp; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100, for molecular biology,&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Mouse anti-Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td></tr><tr><td>Rat anti-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td></tr><tr><td>Guinea-pig anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Raf2</td><td></td><td></td><td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td></tr><tr><td>DyLight conjugated series&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&amp;nbsp; rabbit or rat) as second antibodies</td></tr></tbody></table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

ショウジョウバエ 精巣は、幹細胞生物学、核アーキテクチャ、微膜および精子の発生を含む生物学的プロセスを研究するための強力なモデルシステムです。しかしながら、 ショウジョウバエ 精巣全体の免疫標識は、抗体の浸透による染色の有意な不均一性と関連していることが多い。押しつぶされた準備は、解析の3D品質を低下させるので、部分的に問題を克服するだけです。本明細書において、我々は、液体媒体中の免疫標識と共に固定中にNP40およびヘプタンを用いた全実装プロトコルについて述べている。それは再生可能で信頼できるラベル付けと共に共焦点顕微鏡に適した容積を維持する。我々は、共焦点部からの精子細胞核の3D再構成の異なる例を示す。検査中および間の試験の再現性により、異なる遺伝子型の単一細胞間の 蛍光 を3D定量および比較することができます。我々は、核内MINT構造(Mad1含有核内領域)の異なる成分と、核孔複合体に関連する2つの成分を使用して、このプロトコルとその精巣の最大細胞S4-S5精子細胞への応用を説明した。

ショウジョウバエ精巣の適切な染色を得るための主な障害は、部分的に押しつぶされた製剤を使用して解決されたが、3D分析の制限(例えば3D表現または共局在化の尺度)を犠牲にして解決された抗体の限られた浸透性である。この手順では、均一なラベルを作成でき、精巣のすべての細胞の体積を保持します。ここでは、S4-S5精子細胞の3D表現に関する方法のイラストを、それらが最大の細胞であり、したがって、スカッシュからの変形に敏感であるように焦点を当てました。我々は、有糸タンパク質Mad112によって記述される核内MINTドメイン(Mad1含有核内領域)の核内MINTドメインのラベリングと核内の標識を含む異なる核マーカーを用いた。MINTは複数の異なる抗体によって明らかにすることができるので、我々はそれらを使用して、定量的3D共局在化のためのプロトコルの堅牢性をテストし、正しい空間分解能を必要とする方法である。
上述のプロトコルは、3D再構成のために処理される十分な品質の共焦点画像の取得を可能にする。S5段の隣接する4つの連続セクションが 図1Aに描かれているが、DAPI(シアン)と共にMINT(GFPブースターを赤色で使用したMad1免疫標識)の代表的な免疫染色を示す。染色体は特徴的な3つの主要な異なるクラスターに編成され、MINT構造はDNAの周りに細かく詳細に示され、常染色体塊と密接に関連しているが、異なる。この決議はまた、核周辺でのMad1の存在と、染色体2と3の常染色体塊の間の検出も可能にする。3D表現にはイマリスのソフトウェアを使用しました。核表面は、核エンベロープにおけるMad1の低レベル存在(灰色)とMINTの高レベル蓄積(赤)とDAPI染色(青色)によって定義された(図1A)。3D再構成ムービーは、S4-S5精子細胞のステージにおける染色体と共にMad1(核エンベロープとMINT)のボリュームと関係をよく示しています。
ヌクレオポリンの分布は、これらの細胞では十分に記述されておらず、おそらくこれらの大きな不整形核でそれらを検出するのが難しいためである。Nup154の分布は、以前に16とNup153およびNup98が精子および小さな、初期の精子細胞17でしか研究されなかった一度だけ報告されている。ヌクオポリンNup62および輸入β(ケテル遺伝子の産物)によって染色された大きなS5精子細胞の3D再構成は、それぞれ実現可能であり、図1Cおよび図1Dに示されている。これらの核孔関連成分は、不規則な大きさのドットとして核縁の上に不均一に分布しているように見える。例えば、インポートインβは、ラミンネットワークが既に記述されている場所と同様に、常染色体クロマチンの周りに集まる 3.この種の分布は、孔が豊富な領域と大きな孔のない領域を有する、げっ歯類精子細胞18における電子顕微鏡法によって記述されている。ラミンとヌクレオポリン分布の変化を理解することは、男性の分裂の直前にこれらのG2細胞の核エンベロープ構造を理解するのに役立ちます。
細胞の3D容積を節約しながら、このプロトコルはまた抗体がすべての細胞の深部に均一に浸透することを可能にし、共局在化のような定量的な分析を可能にする。ピアソン相関係数(PCC)は、確立されたメトリックです。それは+1(完全正の相関を示す)から−1(完全負相関)19まで及ぶ。精子細胞におけるMad1に対するMINTパートナータンパク質の局在を評価するために、S5精子細胞12 におけるImageJを用いて0.5μmの単一のセクションでPCCを推定した(図2A,B)。我々は、単なる表面ではなく、核全体に3D共局在化を使用して、プロトコルをより深くテストしました。核の体積は手動セグメンテーションによって定義され、PCCはコロケーションツールを使用して測定された。同じ精巣または異なる精巣から8個のS5精子細胞核を分析した。 図2B はPCCを測定するのに役立った核の3D表現を示す。 図2D は、3つの異なる精巣から8つの異なるS5精子細胞核に対するPCCの測定を示す。PCC 値は 0.6 と 0.75 から変化し、共局在化の高い値を示す、異なっていません。これらは、単一のセクションで定義された PCC と区別できません。したがって、この手順は、再現可能な均一なラベルを可能にし、精巣のすべての細胞の良好な体積を保持します。
このプロトコルは独立した精巣からの共局在化の信頼できる測定を可能にするので、異なるハエノタイプからの染色の比較が可能になった。これは、MTORのために枯渇したWTハエとハエRNAi(後期精子および初期の精子20で実質的な枯渇を達成するDsRNA UASラインとBam-Gal4ドライバの発現によって生成される)を比較してここに示した。共局在化実験で説明したように、Mtor-RNAiが枯渇した精巣と野生型の精巣を解剖し、一緒に固定し、共焦点画像を一定の設定で取得した。これらの条件に従って、個々の細胞の比較が可能になる。我々は、代表Mtor RNAiが枯渇した(上)およびwt(下)細胞(図3)12によって示されるように、MINTがMtorの喪失によって核エンベロープよりも影響を受けていることを観察した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> 図1:異なるプローブを用いたショウジョウバエS4-S5精子細胞核の免疫染色の図示。(A) Mad1-GFP(赤)によりMINT構造を検出したα-GFP抗体(GFPブースター)で免疫染色された1段階5の精子細胞核の画像(青色)をDAPI染色(青)に一緒に行う。これは、Mad1と2つの常染色体質量(アスタリスクとして表される)との関係を正確に示す。Mad1は核の周辺でもかすかに検出される。すべての画像は、3(0.5 μm)連続の共焦点スライスのスタックのシリアルZプロジェクションです。共焦点像は共焦点顕微鏡(63倍、計画アポクロマティックオイルDIC対物レンズ)で取得した。スケールバーは5μm(B)同じ精子細胞核のムービーレンダリングからのフレームである。核表面は核エンベロープ(灰色)におけるMad1の低発現によって定義され、MINTは核内のMad1の高い発現(赤)によって定義された。(A, B)以前に公開された図の許可を得て再印刷(12から)。(C)Nup62(黄色)とMINT(赤でGFPブースター)の同時免疫染色を伴うステージ5精子細胞核の3D画像。スケールバーは、4μm(D)の3D画像である第5段階の精子細胞核を、DNA(青色のDAPI)と共に、インポートβケテル(黄色)の同時免疫染色を伴う。スケールバーは5μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> 図2:Ulp1と共にMad1の2Dおよび3D共局在化の定量化。(A) GFPブースター抗体を用いて免疫染色されたステージ5の精子細胞核の合成画像はMad1(緑色)、および1μm厚層の精子核の厚いスタックとして表される抗Ulp1抗体(赤色)を用いた。右側には、Coloc-2 ImageJプラグインを使用して計算されたピアソン強度相関係数が示されています。PCCは0.73と推定されました(ライヒ12の許可を得て転載)。(B)ステージ5の精子細胞核(隣接表中の核Gに対応する)の合成像は、Mad1(緑色)を検出するGFPブースター抗体で免疫染色し、抗ウルプ1抗体(赤色)を3D投影で表した。核の体積は手動セグメンテーションによって定義された。右側の表には、3つの異なる精巣(1〜3)から8つの異なる精子(A〜H)で計算されたピアソン強度相関係数がリストされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> 図3:野生型と比較したMTOR RNAi処理精子細胞の蛍光免疫分析。MtorRNAi(ID 110218)細胞(上パネル)および野生型細胞(下パネル)を用いてMtorを使ってMtorを枯渇させた細胞は、Mad1、Raf2およびMtorタンパク質について染色された。精巣は固定され、一緒に染色され、同じスライドと同じパラメータで取得された画像に取り付けられました。RNAi細胞は、Mad1-GFPの不在または存在によってWTと区別され得る。この図は、4 x 0.5 μm スタックの最大投影を表しています。スケールバーは5μm(12で以前に公開された図の許可を得て転載されます)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K ビュー.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. 我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

ビデオ: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

のアップライトイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;エッグチェンバース

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

発生生物学

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

生物学

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

フライ精巣における撮像中心体

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山ショウジョウバエ精巣の免疫染色

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のアップライトイメージング

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のアップライトイメージング

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

フライ精巣における撮像中心体

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色

解剖、イメージング、および薬理学的治療： ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山ショウジョウバエ精巣の免疫染色

解剖、イメージング、および薬理学的治療：ショウジョウバエ蛹精巣や独身男性生殖ライン嚢胞のex vivo培養