אנו מודים לפ. וריג'ייזר, ג'יי יוהנסן ה., אוקהורה על נוגדנים וא. דבק, מרכזי המניות של בלומינגטון וינה לזבובים. תודה לסי ג'קסון על הצעות ודיונים מעוררים.

1. אוסף האשכים של דרוזופילה
הערה: זכרים צעירים (0-15 שעות לאחר eclosion) נחוצים לבדיקת תאי נבט דיפלואיד (כלומר, זרעונים וזרע).
<ol><li>בחר זבובים צעירים ככל האפשר כדי למזער את ההפרעה מפיתוח spermatids.</li>
	<li>הרדמה זבובים על ידי חשיפה קצרה פחמן דו חמצני ולהעביר כרית זבוב14,15.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה 10x), השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש.</li>
	<li>העבר 5 עד 10 זבובים ערופים ל 100 μL של חיץ של רינגר (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 מ"מ EDTA, מעכב חלבון מלא, pH 6.8) על שקופית זכוכית מצופה סיליקון על תמיכה ברקע שחור.</li>
	<li>עם ניתוח מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40, השתמש בזוג אחד של מלקחיים מספר 5 כדי להחזיק זבוב בין בית החזה לבטן, ועם מלקחיים אחרים, משוך את הבטן מבית החזה. לבודד במהירות את האשכים ואת הרקמות הסמוכות מן פגר זבוב15 ומניחים טיפה חדשה של חיץ של רינגר על אותה שקופית.</li>
	<li>לאחר כל האשכים מוכנים, לנקות את האשכים מן הרקמות הנותרות (בלוטת עזר ואברי מין חיצוניים).</li>
	<li>הסר מאגר עודף מהשחרור המכיל את האשכים המנותחים. בדרך כלל, השתמש פיפטה p200 עם קצה μL 10 מצויד על גבי קצה 200 μL. זה מאפשר הסרת עודף נוזלי דרך צמצם קטן. מניחים טיפה של 4% תיקון paraformaldehyde על גבי טיפה המכילה את האשכים מנותח, ולאחר מכן להעביר במהירות את האשכים לצינור המכיל פתרון קיבוע טרי.</li>
</ol>2. קיבעון פרפורמלדהיד
<ol><li>הכן 2 מ"ל של פתרון קיבוע ממש לפני השימוש: 600 μL של 4% paraformaldehyde מדולל מלוחים אגירה פוספט (PBS) עם 30 μL של NP40 20% בתוספת 1200 μL של heptane בצינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון 2 mL. השתמש 4% paraformaldehyde ב PBS מוכן 600 μL aliquots ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. זהירות: הפטן ופרפורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם במכסה המנוע. יש להשליך אותם בהתאם לתקנות המכון המארח.</li>
	<li>העבר את האשכים באמצעות מיקרופיפט p200 עם קצה צמצם רחב לפתרון PFA / NP40 / heptane. לנער את הצינור למעלה ולמטה במשך 30 s ביד. ממשיכים לתקן את האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>עצרו את המיקסר הסיבובי והניחו את הצינור בארון תקשורת צינורי כדי לאפשר הפרדת פאזה ואת האשכים להתיישב לתחתית הצינור.</li>
	<li>הסר את כל heptane ואת הפתרון התיקון ולשטוף את האשכים במהירות שלוש פעמים עם 1x PBS.</li>
	<li>העבר לצינור בודד נקי של 200 μL. בצע את כל הדגירות בצינורות קטנים אלה כדי למזער את כמויות הנוגדנים המועסקים.</li>
	<li>הסר מאגר עודף באמצעות מיקרופיפט 200 μL עם P200 וגם קצה P10 מצורף. היזהר לא לשאוף אשכים.</li>
	<li>יש לשמור את האשכים ב-1x PBS על הקרח עד שכל הדגימות יהיו מוכנות.</li>
</ol>3. כתמי נוגדנים בתמיסה
<ol><li>להשליך את PBS ולהשאיר אשכים ב 0.3% PBS-T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא.</li>
	<li>טרום דגירה באותו חיץ בתוספת 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במשך 1 שעות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של הנוגדן העיקרי מדולל ב 0.3% PBS-T בתוספת 5% NGS(שולחן החומרים).</li>
	<li>דגירה הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (או טמפרטורת החדר) עם תסיסה עדינה על נדנדה.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים ב 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. אפשר האשכים להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.</li>
	<li>הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל 1:500 מהסדרה מצומד DyLight.</li>
	<li>דגירה הנוגדן המשני בתא כהה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על הפעולה עם 0.2% PBS-T ו-0.1% PBS-T, בכל פעם למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ב 1x PBS במשך 30 דקות כדי להסיר את חומר הניקוי.</li>
	<li>הוסף 180 μL של פתרון DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS במשך 15 דקות. פתרון המניה הוא 10 מ"ג / מ"ל ב H2O. הימנעו מפתרון מלאי ב- PBS, אשר יכול להפחית את אות הכתמת DAPI על כרומטין מפוזר בזרע גדול יותר.</li>
	<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית נקייה.</li>
	<li>שאפתן אשכים ולשים אותם על השקופית. שטיפת קצה הצמצם הרחב ב-0.1% PBS-T מונעת מה האשכים להידבק לקצה. הסר PBS עודף.</li>
	<li>הוסף טיפה (כ 100 μL) של Citifluor AF1.</li>
	<li>מניחים בעדינות כיסוי זכוכית על הרקמה, מקפידים להימנע מלכידה של בועות אוויר.</li>
	<li>לאטום את הכיסוי לשקופית באמצעות לק ברור.</li>
	<li>שים לב לשקופיות במיקרוסקופ.</li>
</ol>4. ניתוחי קולוקליזציה
<ol><li>השג תמונות קונפוקל. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקל Zeiss LSM 710 (63x Plan שמן אפוכרומטי) ברזולוציית z של 0.5 או 1 מיקרומטר.</li>
	<li>בחר תאים שונים מתוך אשכים עצמאיים.</li>
	<li>יבא תמונות לתוכנת עיבוד (למשל, Imaris).</li>
	<li>הגדר את הגרעין לפי פילוח ידני כדי לא לכלול את הגרעינים השכנים. השתמש בתוכנת קולוק; הוא אוסף את מקדמי המתאם (PCCs) של פירסון בתוך כל אמצעי האחסון בין 2 פלואורופורים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק שיטה לאימונולאבלינג מוצלח של אשכי דרוזופילה בוגרים בכל ההר. כפי שדווח בהליכים אחרים יש להשתמש בזכרים צעירים (אפילו קיצרנו את הגיל לפחות מ -20 שעות לאחר eclosion) כדי למזער את נוכחותם של זרע מתפתח, אשר מסתכן בשיבוש הזרע. הניתוח צריך להיות מהיר ואת דילול הנוגדן חייב להיות מותאם כדי לייעל את יחס אות לרעש21,22,23. מכיוון ששימוש בפרוטוקולים אחרים, לא ראינו כתמים לאורך כל עומק האשכים, פיתחנו שיטת קיבוע המשלבת PFA יחד עם NP40 והפטן. עכשיו אנחנו משתמשים באופן שגרתי 600 μL של 4% paraformaldehyde ב PBS עם 30 μL של 20% NP40 ועוד שני כרכים של heptane. זה קריטי כדי לאפשר חדירה מספקת. הפחתת כמות NP40 עד 10 μL מפחיתה באופן ניכר את התיוג. כל השלבים הבאים בוצעו בהשעיה והחוצץ העודף הוסר על ידי מתן אפשרות לאשכים לרדת בעדינות לתחתית הצינור בכוח הכבידה. עבור השלב האחרון בהעברת דגימות לשקופית, אנו שוטפים את הקצה ב- 0.1% PBS-T כדי למנוע מה האשכים להידבק לקונוס. על פי תצפיות, פרוטוקול הכתם האימונוהיסטולוגי עובד היטב עם מגוון חלבונים גרעיניים, כולל הסמנים המשמשים כאן, כמו גם בדיקות של שינויים היפונטים אפיגנטיים, למין וגרעינים. נציין כי הפרוטוקול יכול לשמש גם עבור אשכי זחל, ובמקרה זה heptane צריך להיות מושמט, כפי שהוא עושה את האשכים קשה יותר להתאושש ללא פגע.
הפרוטוקול תוכנן במיוחד כדי לשמור על ערימות ניזוק של spermatocytes יחד עבור תיוג יעיל ואחיד של האשכים. הדגמנו את הפרוטוקול עם הזרעונים הגדולים בשלב מאוחר, שגרעינים המעוותים הופכים אותם בין התאים הקשים ביותר לשימור. יתר על כן, ב spermatocytes אלה תיוג גרעיני לעתים קרובות הופך לדלל כנראה בגלל הגודל של הגרעינים. לדוגמה, הוא ציין בדרך כלל כי DAPI או למין תיוג חזק יותר בתאים בשיא האשכים הופך בהדרגה חלש יותר ויותר לפזר כמו spermatocytes גדלים3,24. זה גם יכול להיות אחת הסיבות כי התפלגות של נוקליאופורינים תוארה רק בתאי שלב מוקדם יותר (זרע ו spermatocytes מוקדם)17.
תמונות מצוינות של immunostaining של זרע S5 Drosophila פורסמו, במיוחד עבור t-BRD ספציפי לאשכים וחלבונים דני25,26 באמצעות פרוטוקול נתרן deoxycholate 0.3% או בעקבות מעוך של הרקמה21,22. בידינו, סקווש מוביל לאי אחידות משמעותית של כתמים במעמקי האיבר וגם להקריב את המבנה 3D. גם אם השימוש של 0.3% נתרן deoxycholate נתן תוצאות טובות יותר, עדיין ראינו אי אחידות. לכן, אנו מעדיפים NP40 עבור הרבייה שלה ואיכות התיוג. התמונות confocal לאפשר שחזור של תמונות 3D עבור חלבונים גרעיניים. לדוגמה, יישמנו בהצלחה שיטה זו באמצעות בדיקות רבות ושונות, מאויר כאן על ידי תחום MINT תוך גרעיני, הקשורים קשר הדוק עם מסות כרומטין אוטוזומלי ורשת הנקבוביות הגרעינית. הפצה תלת מימדית מסקרנת של נקבוביות גרעיניות של גרעיני זרע אלה זמינה כעת למחקרים נוספים. התמונות מאפשרות כימות לשחזור של קולוקליזציה מזרעונים שונים מאותם אשכים ומאשכים שונים. למיטב ידיעתנו זו הפעם הראשונה שכימות מדויק על ידי מקדם המתאם פירסון נמדד על דגימות כאלה. זה נותן את הביטחון הנדרש עבור השוואת רמות חלבון immunolabelled מדויק של אשכים שונים.

אשכי דרוזופילה הם מודל בעל ערך לחקר האדריכלות הגרעינית. בתאי זרע מיטוטיים, הנפח הגרעיני תפוס במידה רבה על ידי כרומטין. תאים אלה עוברים ארבעה סבבים של חלוקה, לייצר ציסטה של 16 זרעונים ראשוניים. במהלך הימים הבאים, spermatocytes לעבור 6 שלבים התפתחותיים (S1-S6), גדל מאוד בנפח, בקירוב 20-פי1,2. הם גם משנים את המורפולוגיה הגרעינית שלהם. קווי המתאר של הגרעין, המתגלה על ידי למין Dm0, הופך לא סדיר ומראה invaginations עמוק1,3. זה מלווה בשינויים ושינויים נרחבים בביטוי גנים בארגון כרומטין1,4,5,6,7. הכרומוזומים הבין-פאזיים מוגדרים היטב בשלב S4-S5, ויוצרים שלוש מסות נפרדות המתאימות ל-2 האוטוסומים הדו-כיווניים העיקריים ולזוג ה-X-Y המעוגן בגרעין.
Mad1 היה מבודד במקור כמרכיב מרכזי במחסום המיטוטי (נבדק בשנת8). ב interphase, הוא מתואר כממוקם בעיקר על המעטפה הגרעינית, אלא גם בגרעין9,10,11. במבחן דרוזופילה, דיווחנו כי Mad1 בולט בגרעין, הקשור באופן אינטימי עם שתי מסות כרומטין אוטוזומליות גדולות ובמידה פחותה עם כרומטין XY. הגדרנו מבנה זה הקשור לכרומטין כ- MINT (טריטוריה תוך-גרעינית המכילה Mad1)12. ארבעה חלבונים אחרים היו קשורים MINTs ב spermatocytes: הגרעין Mtor / Tpr, פפטידאז SUMO Ulp1, חלבון מחסום מיטוטי Mad2 ו subunit של קומפלקס דמוי פוליקומב Raf212.
כדי להשלים את התיאור של MINTs, היינו צריכים להשתמש בנוגדנים והתמודדנו עם הבעיות הטכניות שנתקלו בדרך כלל עם immunostaining ב testis: חדירות ירודה וכתוצאה מכך אי אחידות משמעותית של כתמים בעומק האשכים, במיוחד בזרעונים הגדולים. ההכנות המודלגות הגבירו את הגישה לנוגדנים אך הובילו לתמונות דחוסות, הגבילו את הניתוחים התלת-ממדיים ומניעת מדידה של פלואורסצנטיות כמותית, כולל קולוקליזציה. הבעיה של חדירת נוגדנים יכולה להיות מטופלת גם על ידי סוכנים מחלחלים כגון 0.3% Na deoxycholate13, אבל הליך זה לא בידיים שלנו להניב תוצאות לשחזור. מכיוון שביצענו ניסויים רבים בתיוג משותף, חיפשנו לשפר את פרוטוקול ההחלחלה. השילוב של 1% NP40 בתוספת הפטאן הביא לשחזור רב יותר, במיוחד בחקר הזרעונים הגדולים.
פרוטוקול זה מבצע קיבעון ו immunostaining של האשכים בהשעיה, שיפור איכות המדגם, כמו גם שיפור הרבייה, ועיבוד זה מתאים מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בפרוטוקול כדי להגדיר טוב יותר את היחסים המרחביים של חלבוני מעטפה גרעינית מסוימים עם המבנים הגרעיניים של זרעונים גדולים. שיטה זו תאפשר חקירות טובות יותר של השינויים המלווים את התפתחות הזרע, למשל השינויים המבניים הדינמיים של הגרעין כולל כרומטין, גרעין והנקבוביות הגרעיניות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

אשכי דרוזופילה הם מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים כולל ביולוגיה של תאי גזע, ארכיטקטורה גרעינית, מיוזיס והתפתחות זרע. עם זאת, immunolabeling של האשכים Drosophila כולו קשורה לעתים קרובות עם אי אחידות משמעותית של כתמים עקב חדירת נוגדנים. ההכנות מעוכות רק חלקית להתגבר על הבעיה שכן הוא מקטין את איכות 3D של הניתוחים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול הרכבה שלם באמצעות NP40 והפטן במהלך הקיבעון יחד עם immunolabeling במדיה נוזלית. הוא משמר את עוצמת הקול המתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו מראים דוגמאות שונות של שחזור תלת מימדי של גרעיני זרע מחלקים קונפוקליים. השחזור התוך-אשכים והבין-אשכים מאפשר כימות תלת-ממדי והשוואה של פלואורסצנטיות בין תאים בודדים מגנוטיפים שונים. השתמשנו ברכיבים שונים של מבנה MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) כמו גם בשני רכיבים הקשורים למתחם הנקבוביות הגרעיניות כדי להמחיש פרוטוקול זה ויישומים שלו על התאים הגדולים ביותר של האשכים, הזרעונים S4-S5.

המכשול העיקרי להשגת כתמים נאותים של אשכי Drosophila הוא חדירה מוגבלת של נוגדנים, אשר נפתרה חלקית באמצעות הכנות מעוכות אבל במחיר של גרימת הגבלה של ניתוחים 3D (למשל ייצוג 3D או מידה של colocalization). הנוהל מאפשר תיוג אחיד ומשמר את נפח כל תאי האשכים. כאן מיקדנו את האיור של השיטה על ייצוג 3D של זרע S4-S5, כפי שהם התאים הגדולים ביותר ולכן רגישים יותר עיוות מן הסקווש. השתמשנו בסמנים גרעיניים שונים, כולל נוקלאופורינים ותיוג תחום MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) המתואר על ידי החלבון המיטוטי Mad112. כמו MINTs יכול להתגלות על ידי מספר נוגדנים שונים, השתמשנו בהם כדי לבדוק את החוסן של הפרוטוקול עבור colocalization 3D כמותי, שיטה המחייבת רזולוציה מרחבית נכונה.
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר רכישה של תמונות confocal באיכות מספקת כדי להיות מטופלים לאחר מכן עבור שחזור 3D. באיור 1Aמתוארים ארבעה קטעים סדרתיים סמוכים של שלב S5, המציגים חיסון מייצג של MINT (אימונולאבלינג Mad1 באמצעות מאיץ GFP באדום) יחד עם DAPI (בציאן). הכרומוזומים מאורגנים ב-3 הצבירים השונים העיקריים ומבנה MINT מוצג בפירוט רב סביב הדנ"א, הקשור באופן אינטימי לגושי הכרומטין האוטוסומליים. ההחלטה מאפשרת גם גילוי נוכחות של Mad1 בפריפריה הגרעינית, כמו גם בין מסות אוטוזומליות של כרומוזומים 2 ו -3. השתמשנו בתוכנת אימריס לייצוג תלת מימדי. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי נוכחות ברמה נמוכה של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפור) ו- MINT הוגדר על ידי הצטברות ברמה גבוהה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום) יחד עם כתמי DAPI (בכחול)(איור 1A). סרט ההשבה התלת מימדית ממחיש היטב את עוצמת הקול ואת מערכת היחסים של Mad1 (במעטפת הגרעינית ובמטבעה) יחד עם הכרומוזומים בשלב S4-S5 זרעונים.
התפלגות הגרעינים תוארה רק בצורה גרועה בתאים אלה, ככל הנראה בשל הקושי לזהות אותם בגרעיני מעוותים גדולים אלה. ההתפלגות של Nup154 דווחה רק פעם אחת בעבר16 ו Nup153 ו Nup98 נחקרו רק זרעונים קטנים, זרע מוקדם17. שחזורים תלת-ממדיים של זרעונים S5 גדולים מוכתמים על ידי nucleoporin Nup62 ועל ידי יבוא β (תוצר של הגן ketel) היו ריאליים מיוצגים באיור 1C ואיור 1D, בהתאמה. רכיבים גרעיניים אלה הקשורים לנקבוביות מופיעים באופן לא אחיד מפוזרים על שפת הגרעין כנקודות בגודל לא סדיר. לדוגמה, β היבוא מתכנס סביב הכרומטין האוטוסומלי בדומה למקום שבו רשת למין כבר תוארה3. סוג זה של הפצה עם אזורים עשירים בנקבוביות ואזורים גדולים ללא נקבוביות תואר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים בזרע מכרסמים18. הבנת השינויים בחלוקת למין וגרעיני הגרעין תסייע להבין את מבנה המעטפה הגרעינית בתאי G2 אלה ממש לפני מיוזיס זכר.
תוך שמירה על נפח 3D של התאים פרוטוקול זה גם מאפשר נוגדנים לחדור באופן אחיד לתוך העומק של כל תא, המאפשר ניתוח כמותי כגון קולוקליזציה. מקדם המתאם פירסון (PCC) הוא מדד מבוסס היטב. זה יכול לנוע בין +1 (המציין מתאם חיובי מושלם) ל -1 (מתאם שלילי מושלם)19. כדי להעריך את לוקליזציה של חלבונים שותפים MINT יחסית Mad1 ב spermatocytes, הערכנו בעבר את PCC על קטע אחד של 0.5 מיקרומטר באמצעות ImageJ ב S5זרעונים 12 (איור 2A,B). בדקנו את הפרוטוקול לעומק על ידי שימוש בקולוקליזציה תלת-ממדית על כל הגרעינים במקום רק על משטח. נפח הגרעינים הוגדר על ידי פילוח ידני וה- PCC נמדד באמצעות כלי הקולוקציה. ניתחנו שמונה גרעיני זרע S5, מאותם אשכים או אשכים שונים. איור 2B מציג ייצוג תלת-ממדי של גרעין ששימש למדידת ה-PCC. איור 2D מציג את המדידה של ה-PCC בשמונה גרעיני זרע S5 שונים משלושה אשכים שונים. ערכי PCC אינם שונים, משתנים בין 0.6 ו- 0.75, המציין ערך גבוה עבור colocalization. אלה אינם ניתנים להבחנה מה- PCC המוגדר במקטע יחיד. לפיכך, ההליך מאפשר תיוג אחיד לשחזור ושומר על נפח טוב של כל תאי האשכים.
מכיוון שהפרוטוקול מאפשר מדידה אמינה של קולוקליזציה מניסויים עצמאיים, הוא התיר השוואה של כתמים מגנוטיבים שונים של זבובים. זה הומחש כאן על ידי השוואה של זבובים זבובים WT וזבובים RNAi מדולדל עבור Mtor (נוצר על ידי ביטוי של קווי DSRNA UAS ואת הנהג באם-Gal4 להשיג דלדול משמעותי זרע מאוחר spermatogonia ו spermatocytes מוקדם20). כפי שתואר בניסויי קולוקליזציה, אשכים מרוקנים Mtor-RNAi ואשכים מסוגי בר נותחו ותוקנו יחד והתמונות הקונפוקל נרכשו תחת הגדרות קבועות. כיבוד תנאים אלה, ההשוואה של תאים בודדים הופכת לאפשרית. ראינו כי MINT מושפע יותר מאשר המעטפה הגרעינית על ידי אובדן Mtor כפי שמוצג על ידי נציג Mtor RNAi מדולדל (העליון) ו wt (התחתון) תאים (איור 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> איור 1: איור של חיסון גרעיני זרע S4-S5 של דרוזופילה באמצעות בדיקות שונות. (A) תמונות של גרעין זרע שלב יחיד 5 immunostained עם נוגדן α-GFP (GFP המאיץ) גילוי מבנה MINT על ידי Mad1-GFP (אדום) יחד כדי כתמי DAPI (כחול). זה מראה בדיוק את היחסים בין Mad1 לבין שני מסות כרומטין אוטוזומלי (מיוצג כ כוכביות). Mad1 מזוהה גם במעט בפריפריה של הגרעין. כל התמונות הן הקרנות Z טוריות של ערימה של 3 (0.5 מיקרומטר) פרוסות קונפוקל רצופות. תמונות קונפוקל נרכשו על מיקרוסקופ confocal (63x, תוכנית שמן אפוכרומטי DIC עדשה אובייקטיבית). סרגלי קנה המידה הם 5 מיקרומטר. (B) מסגרת מתוך עיבוד סרט של אותו גרעין זרע. המשטח הגרעיני הוגדר על ידי ביטוי נמוך של Mad1 במעטפה הגרעינית (באפורים) ו MINT הוגדר על ידי ביטוי גבוה של Mad1 בתוך הגרעין (באדום). (A, B) הודפס מחדש באישור מאיור שפורסם בעבר (מ-12). (C)תמונה תלת-ממדית של גרעין זרע שלב 5 עם חיסון בו זמנית של Nup62 (צהוב) ו- MINT (זריקת GFP באדום). סרגל קנה המידה הוא 4 מיקרומטר.(D)3D תמונה של גרעין זרע שלב 5 עם immunostaining בו זמנית של יבואן-β קטל (צהוב) יחד עם DNA (DAPI בכחול). סרגלי קנה המידה הם <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank"></a> 5 מיקרומטר.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> איור 2: כימות קולוקליזציה דו-ממדי ותלת-ממדי של Mad1 יחד עם Ulp1. (A) תמונות ממוזגות של גרעין זרע שלב 5 immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג כערימה עבה 1 מיקרומטר של גרעין זרע. בצד ימין מצוין מקדם מתאם עוצמת פירסון מחושב באמצעות תוסף Coloc-2 ImageJ. ה-PCC הוערך ב-0.73 (הודפס מחדש באישור רייך12). (B) תמונה ממוזגת של גרעין זרע שלב 5 (המקביל לגרעין G בטבלה הסמוכה) immunostained עם נוגדן המאיץ GFP גילוי Mad1 (ירוק) ועם נוגדן אנטי Ulp1 (אדום) מיוצג בהקרנה 3D. נפח הגרעין הוגדר על ידי פילוח ידני. מימין, הטבלה מפרטת את מקדמי המתאם בעוצמת פירסון המחושבים על 8 זרעונים שונים (A עד H) מ-3 אשכים שונים (1 עד 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> איור 3: ניתוח כשל חיסוני של זרעונים שטופלו ב-Mtor RNAi בהשוואה לסוג הבר. תאים מרוקנים של Mtor באמצעות MtorRNAi (מזהה 110218) תאים (לוחות עליונים) ותאי סוג בר (לוחות נמוכים) היו מוכתמים עבור חלבוני Mad1, Raf2 ו Mtor. האשכים היו קבועים ומוכתמים יחד, רכובים על אותה שקופית ותמונות שנרכשו באותם פרמטרים. ניתן להבחין בין תאי RNAi לבין WT על ידי היעדרות או נוכחות בהתאמה של Mad1-GFP. האיור מייצג תחזיות מרביות של 4 x 0.5 μm ערימות. סרגל קנה המידה הוא 5 מיקרומטר (הודפס מחדש עם הרשאה מאיור שפורסם בעברב- 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Views.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...