Agradecemos a P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por los anticuerpos y A. Debec, los centros de stock de Bloomington y Viena para las moscas. Gracias a C. Jackson por sus sugerencias y discusiones estimulantes.

1. Colección de testículos de Drosophila
NOTA: Los varones jovenes (0-15 h poste-eclosion) son necesarios para examinar las células de germen diploides (es decir, espermatogonia y spermatocytes).
<ol><li>Seleccione las moscas jóvenes tanto como sea posible para minimizar la interferencia del desarrollo de espezátidas.</li>
	<li>Anestesiar a las moscas por breve exposición al dióxido de carbono y transferir a una almohadilla de mosca14,15.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección (aumento de 10x), use fórceps para extraer la cabeza.</li>
	<li>Transfiera de 5 a 10 moscas decapitadas a 100 μL del tampón de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inhibidor completo de proteínas, pH 6.8) en un portaobjetos de vidrio recubierto de silicona sobre un soporte de fondo negro.</li>
	<li>Con el microscopio de disección con un aumento de 40x, use un par de pórceps número 5 para sostener una mosca entre el tórax y el abdomen y, con otros tórceps, aleje el abdomen del tórax. Aísle rápidamente los testículos y los tejidos adyacentes de la canal de la mosca15 y colóquelos en una nueva gota del tampón de Ringer en el mismo portaobjetos.</li>
	<li>Una vez que todos los testículos estén listos, limpie los testículos de los tejidos restantes (glándula accesoria y genitales externos).</li>
	<li>Elimine el exceso de búfer de la gota que contiene los testículos disecados. Por lo general, utilice una pipeta p200 con una punta de 10 μL instalada encima de una punta de 200 μL. Esto permite la eliminación del exceso de líquido a través de una pequeña abertura. Coloque una gota de fijador de paraformadehído al 4% en la parte superior de la gota que contiene los testículos disecados, y luego transfiera rápidamente los testículos a un tubo que contenga una solución fijadora fresca.</li>
</ol>2. Fijación de paraformadehído
<ol><li>Preparar 2 mL de solución fijadora justo antes de su uso: 600 μL de paraformadehído al 4% diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 30 μL de NP40 al 20% más 1200 μL de heptano en un tubo de microcentrífuga siliconado de 2 mL. Utilizar paraformadehído al 4% en PBS preparado en alícuotas de 600 μL y almacenado a -20°C. Precaución: El heptano y el paraformaldehído son tóxicos y deben manipularse en una campana extractora de humos. Disponer de ellos de acuerdo con las regulaciones del instituto anfitrión.</li>
	<li>Transfiera los testículos usando una micropipeta p200 con una punta de apertura amplia a la solución PFA/NP40/heptano. Agite el tubo hacia arriba y hacia abajo durante 30 s a mano. Continuar fijando los testículos en una batidora rotativa a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Detenga la mezcladora rotativa y coloque el tubo en un estante de tubos para permitir la separación de fases y para que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Retire todo el heptano y la solución fijadora y enjuague los testículos rápidamente tres veces con 1x PBS.</li>
	<li>Transferir a un tubo individual limpio de 200 μL. Realizar todas las incubaciones en estos pequeños tubos para minimizar las cantidades de anticuerpos empleadas.</li>
	<li>Retire el exceso de tampón utilizando una micropipeta de 200 μL con una punta P200 y una P10 conectadas. Tenga cuidado de no aspirar testículos.</li>
	<li>Mantenga los testículos en 1x PBS sobre hielo hasta que todas las muestras estén listas.</li>
</ol>3. Tinción de anticuerpos en solución
<ol><li>Deseche el PBS y deje los testículos en PBS-T al 0,3% durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares.</li>
	<li>Pre-incubar en el mismo almacenador intermediario más el suero normal de la cabra del 5% (NGS) para 1 h.</li>
	<li>Añadir 200 μL del anticuerpo primario diluido en PBS-T al 0,3% más NGS al 5%(Tabla de Materiales).</li>
	<li>Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (o temperatura ambiente) con agitación suave en un balancín.</li>
	<li>Lavar 3 veces en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Permita que los testículos se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad.</li>
	<li>Añadir 200 μL de anticuerpo secundario diluido 1:500 de la serie conjugada DyLight.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario en una cámara oscura durante 4 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar en PBS-T al 0,3% durante 15 min en un balancín a temperatura ambiente. Después repetir con PBS-T al 0,2% y AL 0,1% PBS-T, cada vez durante 30 min en un balancín a temperatura ambiente. Haga un lavado final en 1x PBS durante 30 min para eliminar el detergente.</li>
	<li>Añadir 180 μL de solución DAPI a 1 μg/mL en 1x PBS durante 15 min. La solución común es de 10 mg/mL enH2O. Evite hacer una solución común en PBS, que puede reducir la señal de tinción dapi en la cromatina difusa en espermatocitos más grandes.</li>
	<li>Lavar 3x durante 5 min cada uno.</li>
	<li>Utilice una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos limpio.</li>
	<li>Aspirar los testículos y ponerlos en la diapositiva. Pre-enjuague de la punta de apertura amplia con 0.1% PBS-T evita que los testículos se peguen a la punta. Elimine el exceso de PBS.</li>
	<li>Añadir una gota (aproximadamente 100 μL) de Citifluor AF1.</li>
	<li>Coloque suavemente una cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire.</li>
	<li>Selle la cubierta a la diapositiva con esmalte de uñas transparente.</li>
	<li>Observe los portaobjetos en un microscopio.</li>
</ol>4. Análisis de colocalización
<ol><li>Adquirir imágenes confocales. Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 710 (aceite apocromático 63x Plan) con una resolución z de 0,5 o 1 μm.</li>
	<li>Seleccione diferentes células de testículos independientes.</li>
	<li>Importe imágenes al software de procesamiento (por ejemplo, Imaris).</li>
	<li>Defina el núcleo por segmentación manual para excluir los núcleos vecinos. Utilice el software Coloc; recoge los coeficientes de correlación de Pearson (PCCs) dentro de todo el volumen entre 2 fluoróforos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. 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(51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método para el immunolabeling acertado de los testículos adultos de Drosophila del entero-montaje. Como se informó en otros procedimientos, se deben usar machos jóvenes (incluso se acortó la edad a menos de 20 horas después de la eclosión) para minimizar la presencia de espermatozoides en desarrollo, lo que corre el riesgo de obstruir los espermatocitos. La disección debe ser rápida y la dilución de anticuerpos debe ajustarse para optimizar la relación señal/ruido21,22,23. Porque usando otros protocolos, no observamos la coloración a través de la profundidad del testículo, desarrollamos un método de la fijación que combinaba PFA junto con NP40 y heptano. Ahora utilizamos rutinariamente 600 μL de paraformadehído al 4% en PBS con 30 μL de 20% de NP40 más dos volúmenes de heptano. Esto es fundamental para permitir una permeabilización suficiente. Reducir la cantidad de NP40 a 10 μL reduce visiblemente el etiquetado. Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo en suspensión y el exceso de tampón se eliminó permitiendo que los testículos descendieran suavemente hasta el fondo del tubo por gravedad. Para el último paso de transferencia de muestras a un portaobjetos, enjuagamos la punta en PBS-T al 0,1% para evitar que los testículos se peguen al cono. Según observaciones, el protocolo de tinción inmunohisistológica funciona bien con una variedad de proteínas nucleares, incluidos los marcadores utilizados aquí, así como sondas de modificaciones epigenéticas de histonas, lamina y nucleoporinas. Observamos que el protocolo también se puede utilizar para los testículos larvales, en cuyo caso el heptano debe omitirse, ya que hace que los testículos sean más difíciles de recuperar intactos.
El protocolo está especialmente diseñado para mantener pilas no dañadas de los espermatocitos juntos para un etiquetado eficiente y uniforme del testículo. Ilustramos el protocolo con los spermatocytes grandes de la última etapa, cuyos núcleos deformes los hacen entre las células más difíciles de preservar. Además, en estos espermatocitos el etiquetado nuclear a menudo se diluye probablemente debido al tamaño de los núcleos. Por ejemplo, se observa comúnmente que el DAPI o etiquetado de lamina es más fuerte en las células en el ápice del testículo y se vuelve progresivamente más débil y más dispersa a medida que los espermatocitos crecen3,24. Esta también podría ser una de las razones por las que la distribución de nucleoporinas sólo ha sido descrita en células en estadios más tempranos (espermatogonia y espermatocitos tempranos)17.
Se han publicado excelentes imágenes de inmunotensión de espermatocitos de Drosophila S5, particularmente para las proteínas t-BRD y dany específicas del testículo25,26 utilizando el protocolo de desoxicolato de sodio al 0,3% o después del aplastamiento del tejido21,22. En nuestras manos, las calabazas conducen a una no uniformidad significativa de la tinción en las profundidades del órgano y también sacrificando la estructura 3D. Incluso si el uso de desoxicolato de sodio al 0,3% dio mejores resultados, todavía observamos falta de uniformidad. Por lo tanto, preferimos NP40 por su reproducibilidad y calidad de etiquetado. Las imágenes confocales permiten la reconstrucción de imágenes 3D para proteínas nucleares. Por ejemplo, hemos aplicado con éxito este método usando muchas puntas de prueba diferentes, ilustradas aquí por el dominio MINT intranuclear, íntimamente asociado con las masas de cromatina de un autosoma y la red de poros nucleares. La distribución 3D intrigante de poros nucleares de estos núcleos del spermatocyte ahora está disponible para otros estudios. Las imágenes permiten la cuantificación reproducible de la colocalización de diferentes espermatocitos del mismo testículo y de diferentes testículos. A nuestro conocimiento ésta es la primera vez que la cuantificación exacta por el coeficiente de correlación de Pearson se ha medido en tales muestras. Proporciona la confianza necesaria para la comparación precisa de los niveles de proteína inmunomarcada de diferentes testículos.

Los testículos de Drosophila son un modelo valioso para el estudio de la arquitectura nuclear. En las células espermatogoniales mitóticas, el volumen nuclear está ocupado en gran medida por la cromatina. Estas células se someten a cuatro rondas de división, produciendo un quiste de 16 espermatocitos primarios. Durante los próximos días, los espermatocitos pasan por 6 etapas de desarrollo (S1-S6), aumentando en gran medida en volumen, aproximadamente 20 veces1,2. También cambian su morfología nuclear. El contorno del núcleo, revelado por la lamina Dm0, se vuelve irregular y muestra profundas invaginaciones1,3. Esto se acompaña de extensos cambios en la expresión génica y modificaciones en la organización de la cromatina1,4,5,6,7. Los cromosomas interfase están bien definidos en la etapa S4-S5, formando tres masas distintas correspondientes a los 2 autosomas bivalentes principales y el par X-Y acoplado con el nucleolo.
Mad1 fue aislado originalmente como un componente clave del punto de control mitótico (revisado en8). En interfase, se describe como situado principalmente en la envoltura nuclear, sino también en el nucleoplasma9,10,11. En el testículo de Drosophila, divulgamos que Mad1 es prominente en el nucleoplasma, asociado íntimo a las dos masas de cromatina de un autosoma principales y en un grado inferior a la cromatina XY. Definimos esta estructura asociada a la cromatina como MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Otras cuatro proteínas se asociaron con MINTs en espermatocitos: la nucleoporina Mtor/Tpr, la SUMO peptidasa Ulp1, la proteína de punto de control mitótico Mad2 y una subunidad de un complejo similar a Polycomb Raf212.
Para terminar la descripción de MINTs, necesitábamos utilizar los anticuerpos y nos enfrentamos con los problemas técnicos encontrados generalmente con immunostaining en testículo: una permeabilidad pobre dando por resultado una no uniformidad significativa de la coloración en la profundidad del testículo, particularmente en los spermatocytes grandes. Slas preparaciones anuladas aumentaron el acceso a los anticuerpos, pero llevaron a imágenes comprimidas, restringiendo los análisis 3D y previniendo la medición de la fluorescencia cuantitativa, incluida la colocalización. El problema de la penetración de anticuerpos también podría abordarse mediante agentes permeabilizantes como el desoxicolato de Na al0,3%,pero este procedimiento no arrojó resultados reproducibles en nuestras manos. Debido a que realizamos muchos experimentos de co-etiquetado, buscamos mejorar el protocolo de permeabilización. La combinación de NP40 del 1% más heptano dio lugar a más reproducibilidad, particularmente en el estudio de los spermatocytes grandes.
Este protocolo realiza la fijación e inmunotensión de los testículos en suspensión, mejorando la calidad de la muestra, así como mejorando la reproducibilidad, y haciéndola adecuada para la microscopía confocal. Utilizamos el protocolo para definir mejor las relaciones espaciales de ciertas proteínas nucleares de la envoltura con las estructuras nucleoplásmicas de espermiocitos grandes. Este método permitirá mejores investigaciones de los cambios que acompañan el desarrollo de los espermatozoides, por ejemplo, los cambios estructurales dinámicos del núcleo, incluyendo la cromatina, el nucleoplasma y los poros nucleares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

Los testículos de Drosophila son un poderoso sistema modelo para estudiar procesos biológicos, incluida la biología de células madre, la arquitectura nuclear, la meiosis y el desarrollo de espermatozoides. Sin embargo, el immunolabeling del testículo entero de Drosophila se asocia a menudo a la no uniformidad significativa de la coloración debido a la penetración del anticuerpo. Las preparaciones aplastadas solo superan parcialmente el problema, ya que disminuye la calidad 3D de los análisis. Adjunto, describimos un protocolo del entero-montaje usando NP40 y heptano durante la fijación junto con immunolabeling en medios líquidos. Conserva el volumen adecuado para la microscopía confocal junto con un etiquetado reproducible y fiable. Mostramos diferentes ejemplos de reconstitución 3D de los núcleos de espermatocitos de secciones confocales. La reproducibilidad intra e inter-testículo permite la cuantificación 3D y la comparación de la fluorescencia entre células individuales de diferentes genotipos. Se utilizaron diferentes componentes de la estructura intranuclear MINT (Mad1-que contiene intra territorio nuclear), así como dos componentes asociados con el complejo de poros nucleares para ilustrar este protocolo y sus aplicaciones en las células más grandes del testículo, los espermatocitos S4-S5.

El principal obstáculo para obtener una tinción adecuada de los testículos de Drosophila es la limitada penetrabilidad de los anticuerpos, que se ha resuelto parcialmente mediante el uso de preparaciones aplastadas pero a costa de inducir una restricción de los análisis 3D (por ejemplo, representación 3D o medida de colocalización). El procedimiento permite un etiquetado uniforme y preserva el volumen de todas las células del testículo. Aquí hemos centrado la ilustración del método en la representación 3D de los espermatocitos S4-S5, ya que son las células más grandes y por lo tanto más sensibles a la deformación por aplastamiento. Se utilizaron diferentes marcadores nucleares, incluyendo nucleoporinas y el etiquetado del dominio intranuclear MINT (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) descrito por la proteína mitótica Mad112. Como los MINTs podían ser revelados por varios anticuerpos diferentes, los utilizamos para probar la robustez del protocolo para la colocalización cuantitativa en 3D, un método que requiere una resolución espacial correcta.
El protocolo descrito anteriormente permite la adquisición de imágenes confocales de calidad suficiente para luego ser tratadas para la reconstitución 3D. Cuatro secciones seriales adyacentes de un espermatocitos en estadio S5 se representan en la Figura 1A, mostrandouna inmunotensión representativa de MINT (Mad1 immunolabeling using GFP booster in red) junto con DAPI (en cian). Los cromosomas se organizan en los 3 racimos distintos principales característicos y la estructura de la MENTA se demuestra en detalle fino alrededor de la DNA, asociada íntimo a--pero distinta de--las masas de un autosoma de la cromatina. La resolución también permite la detección de la presencia de Mad1 en la periferia nuclear, así como entre las masas autosómicas de los cromosomas 2 y 3. Utilizamos el software Imaris para la representación 3D. La superficie nuclear se definió por la presencia de bajo nivel de Mad1 en la envoltura nuclear (en gris) y MINT se definió por la acumulación de alto nivel de Mad1 dentro del núcleo (en rojo) junto con la tinción dapi (en azul) (Figura 1A). La película de reconstitución 3D ilustra bien el volumen y la relación de Mad1 (en la envoltura nuclear y en la MINT) junto con los cromosomas en los espermatocitos de la etapa S4-S5.
La distribución de las nucleoporinas sólo ha sido mal descrita en estas células, probablemente debido a la dificultad para detectarlas en estos grandes núcleos deformes. La distribución de Nup154 sólo ha sido reportada una vez quepreviamente 16 y Nup153 y Nup98 sólo fueron estudiados en la espermatogonia y pequeños espermatocitos tempranos17. Las reconstituciones 3D de grandes espermatocitos S5 teñidos por la nucleoporina Nup62 y por importina β (producto del gen ketel) fueron factibles y están representadas en la Figura 1C y figura 1D,respectivamente. Estos componentes nucleares asociados a los poros aparecen distribuidos de manera no uniforme sobre el borde nuclear como puntos de tamaño irregular. Por ejemplo, la importina β se reúne alrededor de la cromatina autosómica de manera similar a donde ya se ha descrito una red delaminas 3. Este tipo de distribución con áreas ricas en poros y grandes áreas libres de poros ha sido descrita por microscopía electrónica en espermatocitos de roedores18. La comprensión de los cambios en la distribución de lamina y nucleoporina ayudaría a entender la estructura de la envoltura nuclear en estas células G2 justo antes de la meiosis masculina.
Mientras se conserva el volumen 3D de las células, este protocolo también permite que los anticuerpos penetren uniformemente en la profundidad de cada célula, lo que permite el análisis cuantitativo como la colocalización. El coeficiente de correlación de Pearson (PCC) es una métrica bien establecida. Puede variar de +1 (que denota correlación positiva perfecta) a −1 (correlación negativa perfecta)19. Para evaluar la localización de las proteínas asociadas a MINT en relación con Mad1 en espermatocitos, hemos estimado previamente el PCC en una sola sección de 0,5 μm utilizando ImageJ en espermatocitos S512 (Figura 2A,B). Probamos el protocolo más profundamente usando colocalization 3D en los núcleos enteros en vez de apenas una superficie. El volumen de los núcleos fue definido por la segmentación manual y el PCC fue medido usando la herramienta de colocación. Analizábamos ocho núcleos del spermatocyte S5, del mismo testículo o de diversos testículos. La Figura 2B muestra una representación 3D de un núcleo que sirvió para medir el PCC. La Figura 2D muestra la medición del PCC en ocho núcleos diferentes de espermatocitos S5 de tres testículos diferentes. Los valores de PCC no son diferentes, variando de 0,6 y 0,75, lo que indica un valor alto para la colocalización. Éstos son indistinguibles del PCC definido en una sola sección. Así, el procedimiento permite un etiquetado uniforme reproducible y conserva un buen volumen de todas las células del testículo.
Debido a que el protocolo permite la medición confiable de la colocalización a partir de testículos independientes, permitió la comparación de la tinción de diferentes genotipos de mosca. Esto se ilustró aquí mediante la comparación de moscas WT y moscas RNAi agotado para Mtor (generado por la expresión de las líneas de dsRNA UAS y el controlador Bam-Gal4 que logran un agotamiento sustancial en espermatogonias tardías y espermatocitos tempranos20). Según lo descrito para los experimentos del colocalization, los testículos Mtor-RNAi-agotados y los testículos salvajes de los tipos fueron disecados y fijados juntos y las imágenes confocales fueron adquiridas bajo ajustes constantes. Respetando estas condiciones, la comparación de células individuales se hace posible. Observamos que el MINT se ve más afectado que la envoltura nuclear por la pérdida de Mtor como se muestra en las células representativas de Mtor RNAi-agotadas (superior) y wt (inferior)(Figura 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración de inmunotensión de núcleos de espermatocitos Drosophila S4-S5 utilizando diferentes sondas. (A)Imágenes de un núcleo de espermatocitos de una sola etapa 5 inmunotenido con anticuerpo α-GFP (GFP booster) detectando la estructura MINT por Mad1-GFP (rojo) junto a la tinción DAPI (azul). Muestra con precisión la relación entre Mad1 y las dos masas de cromatina autosómicas (representadas como asteriscos). Mad1 también se detecta débilmente en la periferia del núcleo. Todas las imágenes son proyecciones Z en serie de una pila de 3 (0,5 μm) rebanadas confocales sucesivas. Las imágenes confocales fueron adquiridas en un microscopio confocal (63x, lente objetiva apocromática del aceite DIC del plan). Las barras de la escala son 5 μm. (B) Marco de una representación de la película del mismo núcleo del spermatocyte. La superficie nuclear se definió por la baja expresión de Mad1 en la envoltura nuclear (en grises) y MINT se definió por la alta expresión de Mad1 dentro del núcleo (en rojo). (A, B) Reimpreso con permiso de la figura publicada anteriormente (de12). (C)Imagen 3D de un núcleo de espermatocitos en estadio 5 con inmunotensación simultánea de Nup62 (amarillo) y MINT (refuerzo de GFP en rojo). La barra de escala es de 4 μm.(D)imagen 3D de un núcleo de espermatocitos en etapa 5 con inmunotensación simultánea del Ketel importin-β (amarillo) junto con ADN (DAPI en azul). Las barras de escala son de 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> Figura 2: Cuantificación de colocalización 2D y 3D de Mad1 junto con Ulp1. (A)Imágenes fusionadas de un núcleo de espermatocitos en estadio 5 inmunotenido con anticuerpos aceleradores GFP detectando Mad1 (verde) y con anticuerpos anti-Ulp1 (rojos) representados como una pila de 1 μm de espesor de un núcleo de espermatocitos. A la derecha se indica el coeficiente de correlación de intensidad de Pearson calculado utilizando el plugin Coloc-2 ImageJ. El PCC se estimó en 0,73 (reimpreso con permiso de Raich12). (B)Imagen fusionada del núcleo de espermatocitos en estadio 5 (correspondiente al núcleo G en la tabla adyacente) inmunotenido con anticuerpos booster GFP detectando Mad1 (verde) y con anticuerpos anti-Ulp1 (rojos) representados en una proyección 3D. El volumen del núcleo fue definido por la segmentación manual. A la derecha, la tabla enumera los coeficientes de correlación de intensidad de Pearson calculados en 8 espermatocitos diferentes (A a H) de 3 testículos diferentes (1 a 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> Figura 3: Análisis de inmunofluorescencia de espermatocitos tratados con Mtor RNAi en comparación con el tipo salvaje. Las células agotadas de Mtor usando las células de MtorRNAi (identificación 110218) (paneles superiores) y las células de tipo salvaje (paneles inferiores) fueron manchadas para las proteínas Mad1, Raf2 y Mtor. Los testículos fueron fijados y teñidos juntos, montados en la misma diapositiva e imágenes adquiridas con los mismos parámetros. Las células de RNAi se podían distinguir del PESO por la ausencia o la presencia respectivamente de Mad1-GFP. La figura es representativa de las proyecciones máximas de pilas de 4 x 0,5 μm. La barra de escala es de 5 μm (reimpresa con permiso de la figura publicada anteriormente en12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K vistas.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparativos Piso en observación y análisis de embrión de pez cebra muestras teñidas por todo el montaje<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

La disección y la inmunotinción de imaginal discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...