نشكر ب. فيريجزر، ج. يوهانسن ه. ، أوخورا على الأجسام المضادة وألف ديبيك، ومراكز بلومينغتون وفيينا للأسهم للذباب. بفضل جاكسون جيم للاقتراحات وتحفيز المناقشات.

1. مجموعة الخصية دروسوفيلا
ملاحظة: الذكور الصغار (0-15 ساعة بعد انهيار الدماغ) ضرورية لفحص الخلايا الجرثومية ثنائية الديبلويد (أي الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية).
<ol><li>حدد الذباب الصغير قدر الإمكان لتقليل التداخل من تطوير الحيوانات المنوية.</li>
	<li>تخدير الذباب عن طريق التعرض القصير لثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى منصة ذبابة14،15.</li>
	<li>تحت المجهر تشريح (10x التكبير)، واستخدام ملقط لإزالة الرأس.</li>
	<li>نقل 5 إلى 10 الذباب مقطوعة الرأس إلى 100 ميكرولتر من العازلة رينغر (183 MM KCI، 47 mM NaCl، 10 mM تريس-HCI، 1 mM EDTA، مثبط البروتين الكامل، درجة الحموضة 6.8) على شريحة زجاجية مغلفة بالسيليكون على دعم الخلفية السوداء.</li>
	<li>مع تشريح المجهر في التكبير 40x، استخدم زوج واحد من ملقط رقم 5 لعقد ذبابة بين الصدر والبطن، ومع ملقط أخرى، وسحب البطن بعيدا عن الصدر. عزل بسرعة الخصيتين والأنسجة المجاورة من جثة ذبابة15 ومكان في قطرة جديدة من العازلة رينغر على نفس الشريحة.</li>
	<li>مرة واحدة جميع الخصيتين جاهزة، وتنظيف الخصيتين من الأنسجة المتبقية (الغدة الملحقة والأعضاء التناسلية الخارجية).</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت الزائد من الإفلات الذي يحتوي على الخصية تشريح. عادة، استخدم ماصة P200 مع طرف 10 ميكرولتر مزودة على رأس طرف 200 ميكرولتر. وهذا يسمح بإزالة الفائض السائل من خلال فتحة صغيرة. ضع قطرة من 4٪ مثبت بارافورمالديهايد على رأس القطرة التي تحتوي على الخصيتات المشرحة، ثم قم بنقل الخصية بسرعة إلى أنبوب يحتوي على محلول مثبت جديد.</li>
</ol>2. تثبيت بارافورمالدهيد
<ol><li>إعداد 2 مل من محلول التثبيت قبل الاستخدام مباشرة: 600 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد مخففة في ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) مع 30 ميكرولتر من NP40 20٪ بالإضافة إلى 1200 ميكرولتر من الهيبتان في أنبوب طرد مركزي ميكروني سيليكون 2 مل. استخدام 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني أعدت في 600 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية. تحذير: الهيبتان والبارافورمالديهيد سامان ويجب التعامل معهما في غطاء الدخان. التصرف فيها وفقا للوائح المعهد المضيف.</li>
	<li>نقل الخصيتين باستخدام p200 ميكروبايت مع طرف فتحة واسعة إلى حل PFA/NP40/heptane. يهز أنبوب صعودا وهبوطا لمدة 30 ثانية باليد. مواصلة تحديد الخصية على خلاط دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>وقف خلاط دوارة ووضع أنبوب في رف أنبوب للسماح فصل المرحلة والخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
	<li>إزالة جميع heptane والحل المثبت وشطف الخصيتان بسرعة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>نقل إلى أنبوب 200 μL الفردية نظيفة. إجراء جميع الحضانات في هذه الأنابيب الصغيرة لتقليل كميات الأجسام المضادة المستخدمة.</li>
	<li>إزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ميكروبايت 200 ميكرولتر مع كل من P200 وطرف P10 المرفقة. الحرص على عدم تستنشق الخصية.</li>
	<li>إبقاء الخصيتين في برنامج تلفزيوني 1x على الجليد حتى جميع العينات جاهزة.</li>
</ol>3. تلطيخ الأجسام المضادة في الحل
<ol><li>تجاهل برنامج تلفزيوني وترك الخصيتين في 0.3٪ PBS-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ل permeabilize أغشية الخلايا.</li>
	<li>قبل الحضانة في نفس العازلة بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.3٪ PBS-T بالإضافة إلى 5٪ NGS(جدول المواد).</li>
	<li>احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) مع التحريض لطيف على الروك.</li>
	<li>غسل 3 مرات في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. السماح للخصيات لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة 1:500 من سلسلة DyLight المترافقة.</li>
	<li>احتضان الأجسام المضادة الثانوية في غرفة مظلمة لمدة 4 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>غسل في 0.3٪ PBS-T لمدة 15 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر مع 0.2٪ PBS-T و 0.1٪ PBS-T، في كل مرة لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. قم بغسل نهائي في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة لإزالة المنظفات.</li>
	<li>إضافة 180 ميكرولتر من حل DAPI في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 15 دقيقة. حل الأسهم هو 10 ملغ / مل في H2O. تجنب صنع حل الأسهم في برنامج تلفزيوني، والتي يمكن أن تقلل من إشارة تلطيخ DAPI على الكروماتين المنتشر في الحيوانات المنوية أكبر.</li>
	<li>يغسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة نظيفة.</li>
	<li>يستنشق الخصية ووضعها على الشريحة. قبل الشطف تلميح فتحة واسعة مع 0.1٪ PBS-T يمنع الخصيتين من التمسك تلميح. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة.</li>
	<li>إضافة قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من سيتيفلور AF1.</li>
	<li>ضع غطاء زجاجيا برفق فوق الأنسجة، مع الحرص على تجنب محاصرة فقاعات الهواء.</li>
	<li>ختم غطاء على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.</li>
	<li>مراقبة الشرائح على المجهر.</li>
</ol>4. تحليلات التكلس
<ol><li>الحصول على صور confocal. استخدمنا المجهر زايس LSM 710 confocal (63x خطة الزيت أبوكروماتيك) مع دقة z من 0.5 أو 1 ميكرومتر.</li>
	<li>حدد خلايا مختلفة من الخصية المستقلة.</li>
	<li>استيراد الصور إلى برامج المعالجة (مثل Imaris).</li>
	<li>تعريف النواة عن طريق تجزئة يدوية من أجل استبعاد النوى المجاورة. استخدام برنامج كولوك؛ فإنه يجمع معاملات الارتباط بيرسون (PCCs) داخل وحدة التخزين بأكملها بين 2 الفلوروفور.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase.">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, 953-963 (2001).</li><li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components.">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li><li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

يوفر هذا البروتوكول طريقة للتكبيل المناعي الناجح لخصيات Drosophila البالغة الكاملة التركيب. كما ورد في إجراءات أخرى يجب استخدام الذكور الصغار (حتى أننا قصرنا العمر إلى أقل من 20 ساعة بعد الانفجار) لتقليل وجود الحيوانات المنوية النامية، مما يهدد بعرقلة الحيوانات المنوية. يجب أن يكون التشريح سريعا ويجب تعديل تمييع الأجسام المضادة لتحسيننسبة الإشارةإلى الضوضاء 21و22و23. لأنه باستخدام بروتوكولات أخرى ، لم نلاحظ تلطيخ في جميع أنحاء عمق الخصية ، طورنا طريقة تثبيت تجمع بين PFA مع NP40 والهبتان. نحن الآن استخدام روتيني 600 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني مع 30 ميكرولتر من 20٪ NP40 بالإضافة إلى مجلدين من الهيبتان. وهذا أمر بالغ الأهمية للسماح بالتأهيل الكافي. يقلل تقليل مقدار NP40 إلى 10 ميكرولتر بشكل واضح من وضع العلامات. تم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في التعليق وأزيل الحاجز الزائد عن طريق السماح للخصيين بالنزول بلطف إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية. للخطوة الأخيرة نقل العينات إلى شريحة، ونحن شطف تلميح في 0.1٪ PBS-T لمنع الخصيتين التمسك مخروط. ووفقا للملاحظات، يعمل بروتوكول تلطيخ المناعة بشكل جيد مع مجموعة متنوعة من البروتينات النووية، بما في ذلك العلامات المستخدمة هنا، فضلا عن مسابير تعديلات الهستون اللاجينية واللحن والنوكليوبورينات. نلاحظ أنه يمكن أيضا استخدام البروتوكول لاختبارات اليرقات ، وفي هذه الحالة يجب حذف الهيبتان ، لأنه يجعل الخصيتين أكثر صعوبة في التعافي سليمة.
تم تصميم البروتوكول بشكل خاص للحفاظ على أكوام غير التالفة من الحيوانات المنوية معا لوضع علامات فعالة وموحدة من الخصية. قمنا بتصوير البروتوكول مع الخلايا المنوية الكبيرة في مرحلة متأخرة ، والتي تجعلها نواتها المشوهة من بين أصعب الخلايا للحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، في هذه الحيوانات المنوية الوسم النووي غالبا ما يصبح مخفف ربما بسبب حجم النوى. على سبيل المثال، لوحظ عادة أن DAPI أو صفح الوسم هو أقوى في الخلايا في قمة الخصية ويصبح أضعف تدريجيا وأكثر تفريق كما تنموالحيواناتالمنوية 3،24. وهذا يمكن أيضا أن يكون واحدا من الأسباب التي تم وصفها فقط توزيع النيوكليوبورينات في خلايا المرحلة المبكرة (spermatogonia والحيوانات المنوية في وقت مبكر)17.
وقد نشرت صور ممتازة من المناعة من Drosophila S5 spermatocytes، لا سيما بالنسبة للبروتيس محددة t-BRD والبروتينات داني25،26 باستخدام إما 0.3٪ بروتوكول ديوكسيشولات الصوديوم أو بعد سحق الأنسجة21،22. في أيدينا ، تؤدي السحقات إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في أعماق الجهاز وكذلك التضحية بالهيكل ثلاثي الأبعاد. حتى لو كان استخدام 0.3٪ من ديوكسيكولات الصوديوم أعطى نتائج أفضل، ونحن لا تزال لاحظت عدم التوحيد. وبالتالي، فإننا نفضل NP40 لإعادة إنتاجه وجودة وضع العلامات. تسمح الصور الكونفوجكال بإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد للبروتينات النووية. على سبيل المثال، لقد نجحنا في تطبيق هذه الطريقة باستخدام العديد من المسابير المختلفة، الموضحة هنا في مجال MINT داخل النواة، المرتبطة ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية وشبكة المسام النووية. توزيع 3D مثيرة للاهتمام من المسام النووية من هذه النواة spermatocyte متاحة الآن لمزيد من الدراسات. تسمح الصور بالتقيم الكمي القابل للاستنساخ للكولوكاليشن من الخلايا المنوية المختلفة من نفس الخصية ومن الخصيتين المختلفتين. على حد علمنا هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها قياس كمي دقيق من قبل معامل ارتباط بيرسون على مثل هذه العينات. أنه يعطي الثقة المطلوبة لمقارنة مستويات البروتين المناعي دقيقة من الخصيتين مختلفة.

إن الخصيتان Drosophila نموذج قيم لدراسة البنية النووية. في الخلايا المنوية ميتوتيك، وتحتل إلى حد كبير الحجم النووي من الكروماتين. تخضع هذه الخلايا لأربع جولات من الانقسام ، مما ينتج كيسا من 16 خلية منوية أولية. على مدى الأيام القليلة القادمة ، تمر الخلايا المنوية عبر 6 مراحل نمو (S1-S6) ، وزيادة كبيرة في الحجم ، تقريبا 20 أضعاف1،2. كما أنها تغير مورفولوجيا النووية الخاصة بهم. الخطوط العريضة للنواة ، التي كشفت عنها صفح Dm0 ، يصبح غير منتظم ويظهر التغلغل العميق1،3. ويرافق ذلك تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني والتعديلات في chromatin المنظمة1،4،5،6،7. الكروموسومات بين المراحل محددة جيدا في المرحلة S4-S5، وتشكيل ثلاثة كتل متميزة المقابلة لautsomes ثنائية التكافؤ الرئيسية 2 والزوج X-Y رست مع النيوكليولوس.
تم عزل Mad1 أصلا كعنصر رئيسي في نقطة التفتيش mitotic (استعرضت في8). في مرحلة ما بين المراحل، ويوصف بأنه يقع في المقام الأول في المغلف النووي ولكن أيضا في النيوكليوبلازم9،10،11. في اختبار Drosophila ، أبلغنا أن Mad1 بارز في النيوكليوبلازم ، ويرتبط ارتباطا وثيقا بكتلة الكروماتين الذاتية الرئيسية وإلى حد أقل مع الكروماتين XY. لقد حددنا هذا الهيكل المرتبط بالكروماتين على أنه MINT (الإقليم النووي الداخلي المحتوي على Mad1)12. وارتبطت أربعة بروتينات أخرى مع MINTs في الحيوانات المنوية: نوكليوبورين Mtor / Tpr، وS SUMO peptidase Ulp1، وبروتين نقطة تفتيش ميتوتيك Mad2 و وحدة فرعية من مجمع يشبه بوليكومب Raf212.
لإكمال وصف MINTs ، كنا بحاجة إلى استخدام الأجسام المضادة وواجهنا المشاكل التقنية التي تواجه بشكل عام مع التثبط المناعي في الخصية: نفاذية ضعيفة مما يؤدي إلى عدم توحيد كبير للتلطيخ في عمق الخصية ، خاصة في الخلايا المنوية الكبيرة. Sألغت الاستعدادات زيادة الوصول إلى الأجسام المضادة ولكن أدى إلى صور مضغوطة, تقييد التحليلات 3D, ومنع قياس الفلورية الكمية, بما في ذلك كولوكالينج. ويمكن أيضا معالجة مشكلة اختراق الأجسام المضادة من قبل عوامل permeabilizing مثل 0.3٪ Na deoxycholate13، ولكن هذا الإجراء لم يسفر في أيدينا عن نتائج قابلة للاستنساخ. ولأننا قمنا بالعديد من تجارب وضع العلامات المشتركة، فقد تطلعنا إلى تحسين بروتوكول التهيئة. أدى الجمع بين 1٪ NP40 بالإضافة إلى الهيبتان إلى المزيد من القابلية للاستنساخ ، خاصة في دراسة الخلايا المنوية الكبيرة.
هذا البروتوكول ينفذ التثبيت والتلوي المناعي للخصيات في التعليق، وتحسين جودة العينة، فضلا عن تعزيز استنساخ، وجعلها مناسبة للفحص المجهري confocal. استخدمنا البروتوكول لتحديد أفضل للعلاقات المكانية لبعض بروتينات المغلف النووي مع الهياكل النووية للخلايا المنوية الكبيرة. ستسمح هذه الطريقة بإجراء تحقيقات أفضل للتغيرات المصاحبة لتطور الخلايا المنوية ، على سبيل المثال التغيرات الهيكلية الديناميكية للنواة بما في ذلك الكروماتين والنوكليوبلازم والمسام النووية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

الخصيتان Drosophila هي نظام نموذج قوي لدراسة العمليات البيولوجية بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية والهندسة المعمارية النووية وداء الميوس وتنمية الحيوانات المنوية. ومع ذلك ، غالبا ما يرتبط التهيئة المناعية لاختبار Drosophila بأكمله بعدم التوحيد الكبير للتلطيخ بسبب اختراق الأجسام المضادة. المستحضرات المسحقة فقط جزئيا التغلب على المشكلة لأنه يقلل من نوعية 3D من التحليلات. هنا، ونحن نصف بروتوكول كامل جبل باستخدام NP40 وهبتان أثناء التثبيت جنبا إلى جنب مع وضع التوسيل المناعي في وسائل الإعلام السائلة. فهو يحافظ على الحجم المناسب للتنظير المجهري البؤري جنبا إلى جنب مع وضع العلامات القابلة للاستنساخ والموثوق بها. نعرض أمثلة مختلفة على إعادة تشكيل النواة ثلاثية الأبعاد لنوى الخلايا المنوية من أقسام الكونفوجال. تسمح القابلية للاستنساخ داخل الخصيتين وبينهما بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ومقارنة الفلورسينس بين الخلايا المفردة من الأنماط الجينية المختلفة. استخدمنا مكونات مختلفة من هيكل MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) فضلا عن عنصرين المرتبطة مجمع المسام النووية لتوضيح هذا البروتوكول وتطبيقاته على أكبر خلايا الخصية، وs4-S5 الحيوانات المنوية.

العقبة الرئيسية للحصول على تلطيخ كافية من الخصيتين Drosophila هو penetrability محدودة من الأجسام المضادة، والتي تم حلها جزئيا باستخدام الاستعدادات سحقت ولكن على حساب الحث على تقييد التحليلات 3D (على سبيل المثال التمثيل 3D أو قياس الكولوكاليد). يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة ويحافظ على حجم كافة خلايا الخصية. هنا ركزنا التوضيح للطريقة على التمثيل ثلاثي الأبعاد لخلايا الحيوانات المنوية S4-S5 ، لأنها أكبر الخلايا وبالتالي أكثر حساسية للتشوه من السحق. استخدمنا علامات نووية مختلفة، بما في ذلك النيوكليوبورينات ووضع العلامات على مجال MINT داخل النووية (Mad1 التي تحتوي على الأراضي النووية) التي وصفها البروتين ميتوتيك Mad112. وبما أنه يمكن الكشف عن الألغام الدقيقة من خلال عدة أجسام مضادة مختلفة، استخدمناها لاختبار متانة البروتوكول من أجل التكبر الكمي ثلاثي الأبعاد، وهي طريقة تتطلب استبانة مكانية صحيحة.
يسمح البروتوكول المذكور أعلاه بالحصول على صور كونفوكوكال ذات جودة كافية ليتم علاجها بعد ذلك لإعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد. أربعة أقسام تسلسلية متجاورة من مرحلة S5 spermatocyte مصورة في الشكل 1A، تظهر بقعة مناعية تمثيلية من MINT (ماد1 immunolabeling باستخدام معزز GFP باللون الأحمر) جنبا إلى جنب مع DAPI (في سماوي). يتم تنظيم الكروموسومات في المجموعات المميزة 3 الرئيسية المتميزة ويظهر هيكل MINT بالتفصيل الدقيق حول الحمض النووي ، ويرتبط ارتباطا وثيقا مع - ولكن متميزة عن - كتل الكروماتين الذاتية. ويسمح القرار أيضا بالكشف عن وجود ماد 1 في المحيط النووي وكذلك بين الكتل الصبغية الذاتية للكروموسومات 2 و 3. استخدمنا برنامج Imaris للتمثيل ثلاثي الأبعاد. تم تعريف السطح النووي من خلال الوجود المنخفض المستوى ل Mad1 في المغلف النووي (باللون الرمادي) وتم تعريف MINT من خلال تراكم مستوى عال من Mad1 داخل النواة (باللون الأحمر) جنبا إلى جنب مع تلطيخ DAPI (باللون الأزرق) (الشكل 1A). يوضح فيلم إعادة تشكيل ثلاثي الأبعاد حجم وعلاقة Mad1 (في المغلف النووي وفي MINT) جنبا إلى جنب مع الكروموسومات في المرحلة S4-S5 من الحيوانات المنوية.
وقد تم وصف توزيع النيوكليوبورينات بشكل سيئ فقط في هذه الخلايا، وربما يرجع ذلك إلى صعوبة الكشف عنها في هذه النوى المشوهة الكبيرة. تم الإبلاغ عن توزيع Nup154 مرة واحدة فقط في السابق16 ودرس Nup153 و Nup98 فقط في spermatogonia والصغيرة، والحيوانات المنوية في وقت مبكر17. كانت إعادة تشكيل 3D من الخلايا المنوية S5 كبيرة ملطخة Nup62 nucleoporin والاستيراد β (نتاج جين كيتل) ممكنة ويتم تمثيلها في الشكل 1C والشكل 1D، على التوالي. ويبدو أن هذه المكونات النووية المرتبطة بالمسام غير موزعة بشكل موحد على الحافة النووية كنقاط ذات حجم غير منتظم. على سبيل المثال، تجمع β importin حول الكروماتين autosomal على نحو مماثل إلى حيث تم بالفعل وصف شبكة صفح3. وقد وصف هذا النوع من التوزيع مع المناطق الغنية بالمسام والمناطق الكبيرة الخالية من المسام عن طريق المجهر الإلكتروني في الحيوانات المنوية القوارض18. ومن شأن فهم التغيرات في توزيع اللحاء والنوكليوبورين أن يساعد على فهم بنية المغلف النووي في هذه الخلايا G2 قبل إصابة الذكور بالخلايا.
مع الحفاظ على حجم 3D من الخلايا هذا البروتوكول يسمح أيضا الأجسام المضادة لاختراق موحد في عمق كل خلية، مما يسمح التحليل الكمي مثل كولوكالينج. معامل ارتباط بيرسون (PCC) هو مقياس راسخ. يمكن أن تتراوح من +1 (مما يدل على ارتباط إيجابي مثالي) إلى −1 (ارتباط سلبي مثالي)19. لتقييم توطين البروتينات شريك MINT بالنسبة إلى Mad1 في الحيوانات المنوية، ونحن قد قدرت سابقا PCC على قسم واحد من 0.5 ميكرومتر باستخدام ImageJ في S5 spermatocytes12 (الشكل 2A، B). اختبرنا البروتوكول بشكل أعمق باستخدام كولوكالينيس ثلاثي الأبعاد على النوى بأكملها بدلا من مجرد سطح. تم تعريف حجم النوى عن طريق التقسيم اليدوي وتم قياس PCC باستخدام أداة Colocation. قمنا بتحليل ثمانية نواة S5 spermatocyte، من الخصية نفسها أو الخصية المختلفة. ويبين الشكل 2B تمثيلا ثلاثي الأبعاد لنواة عملت على قياس PCC. يظهر الشكل 2D قياس PCC على ثمانية نوى مختلفة S5 spermatocyte من ثلاثة خصيات مختلفة. لا تختلف قيم PCC، وتتراوح بين 0.6 و0.75، مما يشير إلى قيمة عالية للكولوكال. ولا يمكن تمييز هذه الخطوات عن الفريق الحكومي المعني بتغير المناخ المحدد في قسم واحد. وبالتالي، يسمح الإجراء وضع العلامات موحدة استنساخها ويحافظ على حجم جيد من جميع خلايا الخصية.
ولأن البروتوكول يسمح بقياس موثوق به للكولوكالينج من الخصيتين المستقلتين، فقد سمح بالمقارنة بين التلطيخ من الأنماط الجينية الذبابية المختلفة. وقد تجلى هذا هنا بالمقارنة مع الذباب WT والذباب RNAi استنفدت لمتور (ولدت عن طريق التعبير عن خطوط DSRNA UAS وسائق بام Gal4 التي تحقق استنفاد كبير في أواخر spermatogonia والحيوانات المنوية في وقت مبكر20). وكما هو موضح لتجارب التكبر، تم تشريح الخصيتين المنضبتين من Mtor-RNAi واختبارات الأنواع البرية وإصلاحها معا وتم الحصول على الصور الكونفوجال في ظل إعدادات ثابتة. احترام هذه الشروط، مقارنة الخلايا الفردية يصبح ممكنا. لاحظنا أن ال MINT يتأثر أكثر من المغلف النووي بفقدان Mtor كما هو مبين من قبل الممثل Mtor RNAi المنضب (العلوي) و wt (السفلي) الخلايا(الشكل 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> الشكل 1: توضيح من التلطخ المناعي لنوى الخلايا المنوية Drosophila S4-S5 باستخدام مسابير مختلفة. (أ) صور لمرحلة واحدة 5 نواة الحيوانات المنوية مناعة ملطخة α-GFP الأجسام المضادة (GFP الداعم) الكشف عن هيكل MINT بواسطة Mad1-GFP (أحمر) معا لتلطيخ DAPI (الأزرق). فإنه يظهر بدقة العلاقة بين Mad1 واثنين من الجماهير الكروماتين autosomal (ممثلة كعلامات نجمية). كما يتم الكشف عن Mad1 بشكل ضعيف على هامش النواة. جميع الصور هي المسلسل Z-التوقعات من كومة من 3 (0.5 ميكرومتر) شرائح confocal المتعاقبة. تم الحصول على صور Confocal على المجهر confocal (63x، خطة Apochromatic النفط DIC عدسة الهدف). أشرطة مقياس هي 5 ميكرومتر. (ب) الإطار من تقديم الفيلم من نواة spermatocyte نفسه. تم تعريف السطح النووي من خلال التعبير المنخفض عن Mad1 في المغلف النووي (باللون الرمادي) وتم تعريف MINT من خلال التعبير العالي عن Mad1 داخل النواة (باللون الأحمر). (أ, ب) أعيد طبعها بإذن من الرقم المنشور سابقا (من12). (C) صورة ثلاثية الأبعاد لنواة الحيوانات المنوية في المرحلة الخامسة مع وجود مناعة متزامنة ل Nup62 (أصفر) و MINT (معزز GFP باللون الأحمر). مقياس شريط هو 4 ميكرومتر. (D) صورة 3D من نواة الحيوانات المنوية المرحلة 5 مع في وقت واحد مناعة من importin-β كيتل (الأصفر) جنبا إلى جنب مع الحمض النووي (DAPI باللون الأزرق). أشرطة المقياس هي 5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> الشكل 2: 2D و 3D قياس الكمية كولوكاليشن من Mad1 جنبا إلى جنب مع Ulp1. (أ) الصور المدمجة من نواة الحيوانات المنوية المرحلة 5 مناعة ملطخة مع الأجسام المضادة الداعمة GFP الكشف عن Mad1 (الأخضر) ومع الأجسام المضادة Ulp1 (الأحمر) ممثلة ككومة سميكة 1 ميكرومتر من نواة الحيوانات المنوية. على اليمين يشار إلى معامل ارتباط شدة بيرسون المحسوب باستخدام المكون الإضافي Coloc-2 ImageJ. وقدرت PCC إلى 0.73 (طبع بإذن من رايش12). (ب) صورة مدمجة من المرحلة 5 نواة الحيوانات المنوية (المقابلة للنواة G في الجدول المجاور) مناعة ملطخة بأجسام مضادة معززة GFP الكشف عن Mad1 (الأخضر) ومع الأجسام المضادة Ulp1 المضادة (الأحمر) ممثلة في الإسقاط 3D. تم تعريف حجم النواة عن طريق التقسيم اليدوي. على اليمين، يسرد الجدول معاملات ارتباط شدة بيرسون المحسوبة على 8 الحيوانات المنوية المختلفة (من A إلى H) من 3 خصيتين مختلفتين (1 إلى 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل المناعة من الخلايا المنوية المعالجة من Mtor RNAi مقارنة بالنوع البري. كانت الخلايا المستنفدة من Mtor باستخدام MtorRNAi (ID 110218) الخلايا (الألواح العليا) والخلايا البرية (الألواح السفلية) ملطخة ببروتينات Mad1 و Raf2 و Mtor. تم إصلاح الخصيتين وتلطخهما معا ، مثبتة على نفس الشريحة والصور المكتسبة بنفس المعلمات. يمكن تمييز خلايا RNAi عن WT من خلال غياب أو وجود Mad1-GFP على التوالي. يمثل هذا الرقم الإسقاطات القصوى لمداخن 4 × 0.5 ميكرومتر. شريط المقياس هو 5 ميكرومتر (أعيد طبعه بإذن من الرقم المنشور سابقا في12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes at JoVE.com

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكاليشن على الخلايا المنوية الكبيرة S4-S5.

الالتصنت المناعي من الخصيتين Drosophila جبل كله لتحليل Confocal 3D من الحيوانات المنوية الكبيرة

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Views.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. نقدم هنا بروتوكول محسن لإعداد التركيب الكامل والتلوي المناعي لخصيات دروسوفيلا ، ومناسبة للتنظير المجهري الكونفوكوكال ، كما تسمح بوضع علامات قابلة للاستنساخ وموثوق بها. نحن نوضح هذا البروتوكول من خلال التمثيل ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي لتجارب الكولوكا?...

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

إعداد جبل مسطح لمراقبة وتحليل الأجنة الزرد عينات الملون بواسطة جبل الجامعة<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...