Ringraziamo P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura per gli anticorpi e A. Debec, i centri di borsa bloomington e vienna per le mosche. Grazie a C. Jackson per suggerimenti e discussioni stimolanti.

1. Raccolta testes Drosophila
NOTA: I giovani maschi (0-15 ore dopo l'eclosion) sono necessari per esaminare le cellule germinali diploidi (ad esempio spermatogonia e spermatociti).
<ol><li>Seleziona le mosche giovani il più possibile per ridurre al minimo le interferenze derivanti dallo sviluppo di spermatidi.</li>
	<li>Anestetizza le mosche con una breve esposizione all'anidride carbonica e si trasferisce su un fly pad14,15.</li>
	<li>Al microscopio sezionato (ingrandimento 10x), utilizzare le flessione per rimuovere la testa.</li>
	<li>Trasferire da 5 a 10 mosche decapitate a 100 μL del tampone di Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibitore proteico completo, pH 6,8) su uno scivolo di vetro rivestito di silicone su un supporto di sfondo nero.</li>
	<li>Con il microscopio sezionato con un ingrandimento di 40x, utilizzare un paio di forcep numero 5 per tenere una mosca tra il torace e l'addome e, con altre forcep, allontanare l'addome dal torace. Isolare rapidamente i tester e i tessuti adiacenti dalla carcassadi mosca 15 e posizionare in una nuova goccia del buffer di Ringer sullo stesso scivolo.</li>
	<li>Una volta che tutti i teste sono pronti, pulire i teste dai tessuti rimanenti (ghiandola accessoria e genitali esterni).</li>
	<li>Rimuovere il buffer in eccesso dalla goccia contenente i teste sezionati. In genere, utilizzare una pipetta p200 con una punta da 10 μL montata sopra una punta da 200 μL. Ciò consente la rimozione dell'eccesso di liquido attraverso una piccola apertura. Posizionare una goccia del 4% di paraformaldeide fissativa sopra la goccia contenente i tester sezionati, quindi trasferire rapidamente i tester su un tubo contenente soluzione fissante fresca.</li>
</ol>2. Fissazione della paraformaldeide
<ol><li>Preparare 2 ml di soluzione fissativa poco prima dell'uso: 600 μL di paraformaldeide al 4% diluita in salina tamponata di fosfato (PBS) con 30 μL di NP40 20% più 1200 μL di eptano in un tubo di microcentrifugo siliconato da 2 ml. Utilizzare il 4% di paraformaldeide in PBS preparata in aliquote 600 μL e conservata a -20°C. Attenzione: Eptano e paraformaldeide sono tossici e devono essere maneggiati in una cappa aspirante. Smaltirli secondo il regolamento dell'istituto ospitante.</li>
	<li>Trasferire i tester utilizzando una micropipetta p200 con un'ampia punta di apertura alla soluzione PFA/NP40/eptano. Agitare il tubo su e giù per 30 s a mano. Continuare a fissare i tester su un miscelatore rotativo a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
	<li>Arrestare il miscelatore rotante e posizionare il tubo in un rack per tubi per consentire la separazione di fase e per i tester di depositarsi sul fondo del tubo.</li>
	<li>Rimuovere tutto l'eptano e la soluzione fissante e risciacquare rapidamente i tester tre volte con 1x PBS.</li>
	<li>Trasferire in un singolo tubo pulito da 200 μL. Eseguire tutte le incubazioni in questi piccoli tubi per ridurre al minimo le quantità di anticorpi impiegati.</li>
	<li>Rimuovere il buffer in eccesso utilizzando una micropipetta da 200 μL con una punta P200 e una punta P10 attaccata. Fare attenzione a non aspirare teste.</li>
	<li>Conservare i test in 1x PBS sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono pronti.</li>
</ol>3. Colorazione anticorpale in soluzione
<ol><li>Scartare il PBS e lasciare i tester nello 0,3% di PBS-T per 30 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane cellulari.</li>
	<li>Pre-incubare nello stesso tampone più il 5% di siero di capra normale (NGS) per 1 h.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL dell'anticorpo primario diluito nello 0,3% pbs-t più 5% NGS(Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare l'anticorpo primario durante la notte a 4 °C (o temperatura ambiente) con delicata agitazione su un rocker.</li>
	<li>Lavare 3 volte in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Lasciare che i tester si sistemino sul fondo del tubo per gravità.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di anticorpo secondario diluito 1:500 dalla serie coniugata DyLight.</li>
	<li>Incubare l'anticorpo secondario in una camera scura per 4 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare in 0,3% PBS-T per 15 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Quindi ripetere con 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, ogni volta per 30 minuti su un rocker a temperatura ambiente. Fare un lavaggio finale in 1x PBS per 30 minuti per rimuovere il detergente.</li>
	<li>Aggiungere 180 μL di soluzione DAPI a 1 μg/mL in 1x PBS per 15 min. La soluzione stock è di 10 mg/mL in H2O. Evitare di fare soluzione stock in PBS, che può ridurre il segnale di colorazione DAPI sulla cromatina diffusa negli spermatociti più grandi.</li>
	<li>Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su uno scivolo pulito.</li>
	<li>Aspirare i teste e metterli sulla diapositiva. Il preri risciacquo della punta di apertura ampia con PBS-T dello 0,1% impedisce ai tester di attaccarsi alla punta. Rimuovere il PBS in eccesso.</li>
	<li>Aggiungere una goccia (circa 100 μL) di Citifluor AF1.</li>
	<li>Posizionare delicatamente una coverlip di vetro sul tessuto, facendo attenzione a evitare di intrappolare bolle d'aria.</li>
	<li>Sigillare il coverslip allo scivolo utilizzando smalto chiaro.</li>
	<li>Osservare le diapositive al microscopio.</li>
</ol>4. Analisi di colocalizzazione
<ol><li>Acquisire immagini confocali. Abbiamo usato un microscopio confocale Zeiss LSM 710 (olio apocromatico a piano 63x) con una risoluzione z di 0,5 o 1 μm.</li>
	<li>Selezionare celle diverse da tester indipendenti.</li>
	<li>Importare immagini nel software di elaborazione (ad esempio, Imaris).</li>
	<li>Definire il nucleo mediante segmentazione manuale per escludere i nuclei vicini. Utilizzare il software Coloc; raccoglie i coefficienti di correlazione di Pearson (PCC) all'interno dell'intero volume tra 2 fluorofori.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinas-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 71-148 (1993).</li><li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program.">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li><li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAD1:+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms.">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51 (2018).</li><li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores.">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li><li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila.">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li><li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development.">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641 (2011).</li><li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup154,+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene.">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li><li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling.">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li><li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells.">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li><li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), 102-104 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis.">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce un metodo per l'immunoetichettatura di tester di Drosophila adulti a montaggio intero. Come riportato in altre procedure devono essere utilizzati giovani maschi (abbiamo anche ridotto l'età a meno di 20 ore dopo l'eclosion) per ridurre al minimo la presenza di spermatozoi in via di sviluppo, che rischia di ostruire gli spermatociti. La dissezione deve essere rapida e la diluizione degli anticorpi deve essere regolata per ottimizzare il rapporto segnale-rumore21,22,23. Poiché utilizzando altri protocolli, non abbiamo osservato la colorazione per tutta la profondità del testicolo, abbiamo sviluppato un metodo di fissazione che combina PFA insieme a NP40 ed eptano. Ora usiamo regolarmente 600 μL di paraformaldeide al 4% in PBS con 30 μL di 20% NP40 più due volumi di eptano. Questo è fondamentale per consentire una permeabilizzazione sufficiente. Ridurre la quantità di NP40 a 10 μL riduce visibilmente l'etichettatura. Tutti i passaggi successivi sono stati eseguiti in sospensione e il tampone in eccesso è stato rimosso consentendo ai tester di scendere delicatamente verso il fondo del tubo per gravità. Per l'ultimo passaggio di trasferimento dei campioni in una diapositiva, risciacquiamo la punta in PBS-T allo 0,1% per evitare che i teste si attacchino al cono. Secondo le osservazioni, il protocollo di colorazione immunoistologica funziona bene con una varietà di proteine nucleari, compresi i marcatori qui utilizzati, così come sonde di modifiche epigenetiche dell'istono, lamina e nucleoporine. Notiamo che il protocollo può essere utilizzato anche per i teste larvali, nel qual caso l'eptano dovrebbe essere omesso, in quanto rende i teste più difficili da recuperare intatti.
Il protocollo è appositamente progettato per mantenere pile integre degli spermatociti insieme per un'etichettatura efficiente e uniforme del testicolo. Abbiamo illustrato il protocollo con i grandi spermatociti in fase avanzata, i cui nuclei deformi li rendono tra le cellule più difficili da preservare. Inoltre, in questi spermatociti l'etichettatura nucleare diventa spesso diluita probabilmente a causa delle dimensioni dei nuclei. Ad esempio, si osserva comunemente che l'etichettatura DAPI o lamina è più forte nelle cellule all'apice del testicolo e diventa progressivamente più debole e più dispersa man mano che gli spermatociticrescono 3,24. Questo potrebbe anche essere uno dei motivi per cui la distribuzione delle nucleoporine è stata descritta solo nelle cellule in fase precedente (spermatogonia e primi spermatociti)17.
Sono state pubblicate eccellenti immagini di immunostaining di spermatociti Drosophila S5, in particolare per le proteine t-BRD e dany specifiche del testicolo25,26 utilizzando il protocollo dello 0,3% di deossicholato di sodio o dopo lo schiacciamento del tessuto21,22. Nelle nostre mani, le squash portano a una significativa non uniformità di colorazione nelle profondità dell'organo e sacrificano anche la struttura 3D. Anche se l'uso dello 0,3% di deossicolato di sodio ha dato risultati migliori, abbiamo comunque osservato la non uniformità. Pertanto, preferiamo NP40 per la sua riproducibilità e qualità dell'etichettatura. Le immagini confocali consentono la ricostruzione di immagini 3D per proteine nucleari. Ad esempio, abbiamo applicato con successo questo metodo utilizzando molte sonde diverse, illustrate qui dal dominio intranucleare MINT, intimamente associate alle masse di cromatina autosomica e alla rete dei pori nucleari. L'intrigante distribuzione 3D dei pori nucleari di questi nuclei di spermatociti è ora disponibile per ulteriori studi. Le immagini consentono una quantificazione riproducibile della colocalizzazione da diversi spermatociti dello stesso testicolo e da testicoli diversi. Per quanto ne siamo a conoscenza, è la prima volta che su tali campioni viene misurata una quantificazione accurata da parte del coefficiente di correlazione di Pearson. Fornisce la fiducia necessaria per un confronto accurato dei livelli proteici immunoetichettati di diversi tester.

I test di Drosophila sono un modello prezioso per lo studio dell'architettura nucleare. Nelle cellule spermatogoniche mitotiche, il volume nucleare è in gran parte occupato dalla cromatina. Queste cellule subiscono quattro cicli di divisione, producendo una cisti di 16 spermatociti primari. Nei giorni successivi, gli spermatociti passano attraverso 6 stadi di sviluppo (S1-S6), aumentando notevolmente di volume, approssimativamente 20 volte1,2. Cambiano anche la loro morfologia nucleare. Il contorno del nucleo, rivelato dal lamina Dm0, diventa irregolare e mostra profonde invaginazioni1,3. Questo è accompagnato da ampi cambiamenti di espressione genica e modifiche nell'organizzazione della cromatina1,4,5,6,7. I cromosomi interfase sono ben definiti nello stadio S4-S5, formando tre masse distinte corrispondenti ai 2 principali autosomi bivalenti e alla coppia X-Y agganciata al nucleolo.
Mad1 è stato originariamente isolato come componente chiave del checkpoint mitotico (esaminato in8). Nell'interfase, è descritto come situato principalmente all'involucro nucleare ma anche nel nucleoplasma9,10,11. In Drosophila testis, abbiamo riferito che Mad1 è prominente nel nucleoplasma, intimamente associato alle due principali masse di cromatina autosomica e in misura minore alla cromatina XY. Abbiamo definito questa struttura associata alla cromatina come MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Altre quattro proteine erano associate ai TT negli spermatociti: la nucleoporina Mtor/Tpr, la peptidasi Ulp1 suMO, la proteina del checkpoint mitotico Mad2 e una subunità di un complesso simile a Policomb Raf212.
Per completare la descrizione dei MINT, dovevamo usare gli anticorpi e ci siamo trovati di fronte ai problemi tecnici generalmente incontrati con l'immunostaining nel testicolo: una scarsa permeabilità con conseguente significativa non uniformità di colorazione nella profondità del testicolo, in particolare nei grandi spermatociti. Ipreparati s annullati aumentavano l'accesso agli anticorpi ma portavano a immagini compresse, limitando le analisi 3D e impedendo la misurazione della fluorescenza quantitativa, compresa la colocalizzazione. Il problema della penetrazione degli anticorpi potrebbe anche essere affrontato da agenti permeabilizzanti come lo 0,3% di Na deossicholato13, ma questa procedura non ha prodotto nelle nostre mani risultati riproducibili. Poiché abbiamo eseguito molti esperimenti di co-etichettatura, abbiamo cercato di migliorare il protocollo di permeabilizzazione. La combinazione di 1% NP40 più eptano ha portato a una maggiore riproducibilità, in particolare nello studio dei grandi spermatociti.
Questo protocollo esegue la fissazione e l'immunosocienza dei test in sospensione, migliorando la qualità del campione e migliorando la riproducibilità e rendendolo adatto per la microscopia confocale. Abbiamo usato il protocollo per definire meglio le relazioni spaziali di alcune proteine dell'involucro nucleare con le strutture nucleoplasmatiche dei grandi spermatociti. Questo metodo consentirà di esaminare meglio i cambiamenti che accompagnano lo sviluppo degli spermatociti, ad esempio i cambiamenti strutturali dinamici del nucleo, tra cui cromatina, nucleoplasma e pori nucleari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

I test di Drosophila sono un potente sistema modello per lo studio dei processi biologici tra cui la biologia delle cellule staminali, l'architettura nucleare, la meiosi e lo sviluppo dello sperma. Tuttavia, l'immunoetichettatura dell'intero testicolo drosophila è spesso associata a una significativa non uniformità di colorazione dovuta alla penetrazione degli anticorpi. I preparati schiacciati superano solo parzialmente il problema poiché diminuisce la qualità 3D delle analisi. Qui, descriviamo un protocollo a montaggio intero usando NP40 ed eptano durante la fissazione insieme all'immunoetichettatura nei mezzi liquidi. Preserva il volume adatto alla microscopia confocale insieme a etichette riproducibili e affidabili. Mostriamo diversi esempi di ricostituzione 3D dei nuclei di spermatociti da sezioni confocali. La riproducibilità intra- e inter-testes consente la quantificazione 3D e il confronto della fluorescenza tra singole cellule di diversi genotipi. Abbiamo utilizzato diversi componenti della struttura MINT intranucleare (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) e due componenti associati al complesso dei pori nucleari per illustrare questo protocollo e le sue applicazioni sulle più grandi cellule del testicolo, gli spermatociti S4-S5.

Il principale ostacolo all'ottenimento di un'adeguata colorazione dei test di Drosophila è la limitata penetrabilità degli anticorpi, che è stata parzialmente risolta utilizzando preparati schiacciati ma a costo di indurre una restrizione delle analisi 3D (ad esempio rappresentazione 3D o misura della colocalizzazione). La procedura consente un'etichettatura uniforme e preserva il volume di tutte le cellule del testicolo. Qui abbiamo focalizzato l'illustrazione del metodo sulla rappresentazione 3D degli spermatociti S4-S5, in quanto sono le cellule più grandi e quindi più sensibili alla deformazione dalla schiacciamento. Abbiamo usato diversi marcatori nucleari, tra cui le nucleoporine e l'etichettatura del dominio intranucleare MINT (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) descritto dalla proteina mitotica Mad112. Poiché i MITT potrebbero essere rivelati da diversi anticorpi, li abbiamo usati per testare la robustezza del protocollo per la colocalizzazione quantitativa 3D, un metodo che richiede una corretta risoluzione spaziale.
Il protocollo sopra descritto consente l'acquisizione di immagini confocali di qualità sufficiente per poi essere trattate per la ricostituzione 3D. Quattro sezioni seriali adiacenti di uno spermatocita di stadio S5 sono raffigurate nella figura 1A, mostrando un'immunostaining rappresentativa di MINT (Mad1 immunolabeling using GFP booster in red) insieme a DAPI (in ciano). I cromosomi sono organizzati nei caratteristici 3 principali ammassi distinti e la struttura MINT è mostrata in dettaglio attorno al DNA, intimamente associato - ma distinto da - le masse di cromatina autosomica. La risoluzione consente inoltre di rilevare la presenza di Mad1 alla periferia nucleare e tra le masse autosomali dei cromosomi 2 e 3. Abbiamo usato il software Imaris per la rappresentazione 3D. La superficie nucleare è stata definita dalla bassa presenza di Mad1 all'involucro nucleare (in grigio) e MINT è stata definita da un accumulo di alto livello di Mad1 all'interno del nucleo (in rosso) insieme alla colorazione DAPI (in blu)(figura 1A). Il film di ricostituzione 3D illustra bene il volume e la relazione di Mad1 (all'involucro nucleare e nella MINT) insieme ai cromosomi negli spermatociti dello stadio S4-S5.
La distribuzione delle nucleoporine è stata descritta solo male in queste cellule, probabilmente a causa della difficoltà di rilevarle in questi grandi nuclei deformi. La distribuzione di Nup154 è stata riportata solo una voltaprecedentemente 16 e Nup153 e Nup98 sono stati studiati solo nella spermatogonia e piccoli spermatocitiprecoci 17. Le ricostituzioni 3D dei grandi spermatociti S5 macchiati dalla nucleoporina Nup62 e dall'importin β (prodotto del gene ketel) erano fattibili e sono rappresentate rispettivamente nella figura 1C e nella figura 1D. Questi componenti nucleari associati ai pori appaiono distribuiti in modo non uniforme sul bordo nucleare come punti di dimensioni irregolari. Ad esempio, l'β si raccoglie intorno alla cromatina autosomica in modo simile a dove una rete lamina è già stata descritta3. Questo tipo di distribuzione con aree ricche di pori e grandi aree senza pori è stata descritta dalla microscopia elettronica negli spermatociti dei roditori18. Comprendere i cambiamenti nella distribuzione della lamina e della nucleoporina aiuterebbe a comprendere la struttura dell'involucro nucleare in queste cellule G2 poco prima della meiosi maschile.
Pur conservando il volume 3D delle cellule questo protocollo consente anche agli anticorpi di penetrare uniformemente nella profondità di ogni cellula, consentendo analisi quantitative come la colocalizzazione. Il coefficiente di correlazione di Pearson (PCC) è una metrica ben consolidata. Può variare da +1 (denotando una perfetta correlazione positiva) a −1 (perfetta correlazione negativa)19. Per valutare la localizzazione delle proteine partner MINT rispetto a Mad1 negli spermatociti, abbiamo precedentemente stimato il PCC su una singola sezione di 0,5 μm utilizzando ImageJ negli spermatociti S512 (Figura 2A,B). Abbiamo testato il protocollo più profondamente utilizzando la colocalizzazione 3D su interi nuclei invece che solo su una superficie. Il volume dei nuclei è stato definito dalla segmentazione manuale e il PCC è stato misurato utilizzando lo strumento di colocation. Abbiamo analizzato otto nuclei di spermatociti S5, dello stesso testicolo o testicoli diversi. La figura 2B mostra una rappresentazione 3D di un nucleo che è servito a misurare il PCC. La figura 2D mostra la misurazione del PCC su otto diversi nuclei di spermatociti S5 da tre diversi teste. I valori PCC non sono diversi, variando da 0,6 e 0,75, indicando un valore elevato per la colocalizzazione. Questi sono indistinguibili dal PCC definito su una singola sezione. Pertanto, la procedura consente un'etichettatura uniforme riproducibile e conserva un buon volume di tutte le cellule del testicolo.
Poiché il protocollo consente una misurazione affidabile della colocalizzazione da tester indipendenti, ha permesso il confronto della colorazione da diversi genotipi di mosca. Questo è stato illustrato qui dal confronto di mosche e mosche WT RNAi esaurite per Mtor (generato dall'espressione di linee UAS dsRNA e il driver Bam-Gal4 che raggiungono un sostanziale esaurimento nella spermatogonia tardiva e nei primi spermatociti20). Come descritto per gli esperimenti di colocalizzazione, i tester impoveriti di Mtor-RNAi e i tester di tipi selvatici sono stati sezionati e fissati insieme e le immagini confocali sono state acquisite in contesti costanti. Rispettando queste condizioni, il confronto delle singole cellule diventa possibile. Abbiamo osservato che il MINT è più colpito dell'involucro nucleare dalla perdita di Mtor, come dimostrato dalle cellule rappresentative impoverite da Mtor RNAi (superiore) e wt (inferiore)(figura 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione dell'immunostaining dei nuclei di spermatociti Drosophila S4-S5 utilizzando diverse sonde. (A) Immagini di un singolo nucleo di spermatociti allo stadio 5 immunosottenute con anticorpo α-GFP (booster GFP) che rilevano la struttura MINT da Mad1-GFP (rosso) insieme alla colorazione DAPI (blu). Mostra con precisione la relazione tra Mad1 e le due masse di cromatina autosomica (rappresentate come asterischi). Mad1 viene anche debolmente rilevato alla periferia del nucleo. Tutte le immagini sono proiezioni Z seriali di una pila di 3 (0,5 μm) fette confocali successive. Le immagini confocali sono state acquisite su un microscopio confocale (63x, plan Apochromatic oil DIC objective lens). Le barre di scala sono 5 μm. (B) Fotogramma da un rendering cinematografico dello stesso nucleo spermatocita. La superficie nucleare è stata definita dalla bassa espressione di Mad1 all'involucro nucleare (in grigio) e MINT è stata definita da alta espressione di Mad1 all'interno del nucleo (in rosso). (A, B) Ristampato con l'autorizzazione di una figura pubblicata in precedenza(da 12). (C) immagine 3D di un nucleo di spermatociti di stadio 5 con immunosottenimento simultaneo di Nup62 (giallo) e MINT (booster GFP in rosso). La barra di scala è di 4 μm.(D)immagine 3D di un nucleo di spermatociti di stadio 5 con immunosottenimento simultaneo dell'importin-β Ketel (giallo) insieme al DNA (DAPI in blu). Le barre di scala sono di 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> Figura 2: Quantificazione della colocalizzazione 2D e 3D di Mad1 insieme a Ulp1. (A) Immagini fuse di un nucleo di spermatociti di stadio 5 immunosostinte con anticorpo booster GFP che rileva Mad1 (verde) e con anticorpo anti-Ulp1 (rosso) rappresentato come una pila spessa 1 μm di un nucleo spermatocita. A destra è indicato il coefficiente di correlazione di intensità di Pearson calcolato utilizzando il plugin ImageJ Coloc-2. Il PCC fu stimato a 0,73 (ristampato con il permesso di Raich12). (B) Immagine unita del nucleo spermatocita di stadio 5 (corrispondente al nucleo G nella tabella adiacente) immunosostimato con anticorpo booster GFP che rileva Mad1 (verde) e con anticorpo anti-Ulp1 (rosso) rappresentato in una proiezione 3D. Il volume del nucleo è stato definito dalla segmentazione manuale. A destra, la tabella elenca i coefficienti di correlazione dell'intensità di Pearson calcolati su 8 diversi spermatociti (da A a H) da 3 tester diversi (da 1 a 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> Figura 3: Analisi dell'immunofluorescenza degli spermatociti trattati con Mtor RNAi rispetto al tipo selvatico. Le cellule esaurite di Mtor usando cellule MtorRNAi (ID 110218) (pannelli superiori) e cellule di tipo selvaggio (pannelli inferiori) sono state macchiate per le proteine Mad1, Raf2 e Mtor. I tester sono stati fissati e macchiati insieme, montati sullo stesso scivolo e immagini acquisite con gli stessi parametri. Le cellule RNAi potrebbero essere distinte da WT per l'assenza o la presenza rispettivamente di Mad1-GFP. La cifra è rappresentativa delle proiezioni massime di 4 x 0,5 μm pile. La barra di scala è di 5 μm (ristampata con l'autorizzazione della figura precedentemente pubblicatain 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K Views.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. Presentiamo qui un protocollo migliorato per la preparazione a montaggio intero e l'immunostaining dei tester Drosophila, adatto per la microscopia confocale e che consente anche un'etichettatura riproducibile e affidabile. Illustriamo questo protocollo attraverso la rappresentazione 3D e la quantificazione degli esperimenti di colocalizzazione sui grandi spermatociti S4-S5.

Video: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Preparazione di montaggio schermo per l&#39;osservazione e l&#39;analisi di zebrafish campioni macchiato da Whole Monte<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...