Agradecemos p. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura por anticorpos e A. Debec, os centros de ações bloomington e viena para moscas. Obrigado a C. Jackson por sugestões e discussões estimulantes.

1. Coleção de testículos de Drosophila
NOTA: Machos jovens (0-15 h pós-eclosão) são necessários para examinar células germinativas diploides (ou seja, espermatogonia e espermatocitocitos).
<ol><li>Selecione moscas jovens o máximo possível para minimizar a interferência do desenvolvimento de espermatóides.</li>
	<li>Anesthetize voa por breve exposição ao dióxido de carbono e transferência para uma plataformade moscas 14,15.</li>
	<li>Sob um microscópio dissecando (ampliação de 10x), use fórceps para remover a cabeça.</li>
	<li>Transfira 5 a 10 moscas decapitadas para 100 μL do buffer de Ringer (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, inibidor completo de proteína, pH 6.8) em uma lâmina de vidro revestida de silicone em um suporte de fundo preto.</li>
	<li>Com microscópio dissecado em uma ampliação de 40x, use um par de fórceps número 5 para segurar uma mosca entre o tórax e o abdômen, e, com outros fórceps, puxe o abdômen para longe do tórax. Isole rapidamente os testículos e tecidos adjacentes da carcaça15 e coloque em uma nova gota do tampão de Ringer no mesmo slide.</li>
	<li>Quando todos os testículos estiverem prontos, limpe os testículos dos tecidos restantes (glândula acessório e genitália externa).</li>
	<li>Remova o excesso de tampão da gota contendo os testículos dissecados. Normalmente, use uma pipeta p200 com uma ponta de 10 μL instalada em cima de uma ponta de 200 μL. Isso permite a remoção do excesso de líquido através de uma pequena abertura. Coloque uma queda de 4% de paraformaldeído fixador em cima da gota contendo os testículos dissecados e, em seguida, transfira rapidamente os testículos para um tubo contendo solução fixativa fresca.</li>
</ol>2. Fixação de paraformaldeído
<ol><li>Prepare 2 mL de solução fixa pouco antes do uso: 600 μL de 4% de paraformaldeído diluído em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) com 30 μL de NP40 20% mais 1200 μL de heptano em um tubo de microcentrifuge siliconado de 2 mL. Use 4% de paraformaldeído em PBS preparado em alíquotas de 600 μL e armazenado a -20°C. Atenção: Heptano e paraformaldeído são tóxicos e devem ser manuseados em um capô de fumaça. Elimine-os de acordo com as normas do instituto anfitrião.</li>
	<li>Transfira os testículos usando uma micropipette p200 com uma ampla ponta de abertura para a solução PFA/NP40/heptane. Aperte o tubo para cima e para baixo por 30 s à mão. Continue consertando os testículos em uma batedeira rotativa à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Pare a batedeira rotativa e coloque o tubo em um rack de tubo para permitir a separação de fase e para que os testículos se acomodem na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Remova todo o heptano e a solução fixa e enxágue os testículos rapidamente três vezes com 1x PBS.</li>
	<li>Transfira para um tubo individual limpo de 200 μL. Realizar todas as incubações nestes pequenos tubos para minimizar as quantidades de anticorpos empregados.</li>
	<li>Remova o excesso de tampão usando uma micropipette de 200 μL com uma p200 e uma ponta P10 anexada. Tome cuidado para não aspirar testículos.</li>
	<li>Mantenha os testículos em 1x PBS no gelo até que todas as amostras estejam prontas.</li>
</ol>3. Coloração de anticorpos em solução
<ol><li>Descarte o PBS e deixe testículos em 0,3% PBS-T por 30 minutos à temperatura ambiente para permeabilizar as membranas celulares.</li>
	<li>Pré-incubação no mesmo tampão mais 5% de soro de cabra normal (NGS) por 1 h.</li>
	<li>Adicionar 200 μL do anticorpo primário diluído em 0,3% PBS-T mais 5% NGS(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (ou temperatura ambiente) com agitação suave em um roqueiro.</li>
	<li>Lave 3 vezes em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Deixe os testículos se acomodarem na parte inferior do tubo pela gravidade.</li>
	<li>Adicione 200 μL de anticorpo secundário diluído 1:500 da série conjugada DyLight.</li>
	<li>Incubar o anticorpo secundário em uma câmara escura por 4h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave em 0,3% PBS-T por 15 minutos em um roqueiro à temperatura ambiente. Em seguida, repita com 0,2% PBS-T e 0,1% PBS-T, cada vez por 30 min em um roqueiro à temperatura ambiente. Faça uma lavagem final em 1x PBS por 30 minutos para remover o detergente.</li>
	<li>Adicione 180 μL de solução DAPI a 1 μg/mL em 1x PBS por 15 min. A solução de estoque é de 10 mg/mL em H2O. Evite fazer solução de estoque em PBS, o que pode reduzir o sinal de coloração da DAPI em cromatina difusa em espermatocitocitos maiores.</li>
	<li>Lave 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um escorregador limpo.</li>
	<li>Aspirar testículos e colocá-los no slide. Pré-enxaguar a ponta de abertura larga com 0,1% pbs-t impede que os testículos grudem na ponta. Remova o excesso de PBS.</li>
	<li>Adicione uma gota (aproximadamente 100 μL) do Citifluor AF1.</li>
	<li>Coloque delicadamente uma tampa de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar a captura de bolhas de ar.</li>
	<li>Sele a mancha de cobertura no slide usando esmalte transparente.</li>
	<li>Observe slides em um microscópio.</li>
</ol>4. Análises de colocalização
<ol><li>Adquira imagens confocal. Utilizamos um microscópio confocal Zeiss LSM 710 (óleo apocromático plano 63x) com uma resolução z de 0,5 ou 1 μm.</li>
	<li>Selecione diferentes células de testículos independentes.</li>
	<li>Importar imagens para software de processamento (por exemplo, Imaris).</li>
	<li>Defina o núcleo por segmentação manual, a fim de excluir os núcleos vizinhos. Use o software Coloc; ele coleta os coeficientes de correlação (PCCs) do Pearson dentro de todo o volume entre 2 fluoroforos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells.">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li><li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231 (2016).</li><li>Fuller, M. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation.">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li><li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells.">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li><li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy.">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue,+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li><li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation.">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li><li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes.">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo fornece um método para o bem sucedido imunolabeling de testículos de Drosophila adultos de montagem inteira. Conforme relatado em outros procedimentos, devem ser utilizados os machos jovens (até encurtamos a idade para menos de 20 horas após a eclosão) para minimizar a presença de espermatozoides em desenvolvimento, o que corre o risco de obstruir os espermatocitos. A dissecção deve ser rápida e a diluição do anticorpo deve ser ajustada para otimizar a relação sinal-ruído21,22,23. Como usando outros protocolos, não observamos a coloração ao longo da profundidade do testis, desenvolvemos um método de fixação combinando PFA junto com NP40 e heptane. Agora usamos rotineiramente 600 μL de 4% de paraformaldeído em PBS com 30 μL de 20% NP40 mais dois volumes de heptano. Isso é fundamental para permitir a permeabilização suficiente. Reduzir a quantidade de NP40 para 10 μL reduz visivelmente a rotulagem. Todas as etapas subsequentes foram realizadas em suspensão e o excesso de tampão foi removido permitindo que os testículos descessem suavemente para o fundo do tubo por gravidade. Para a última etapa transferindo amostras para um slide, enxaguamos a ponta em 0,1% PBS-T para evitar que os testículos grudem no cone. De acordo com observações, o protocolo de coloração imunohistológica funciona bem com uma variedade de proteínas nucleares, incluindo os marcadores usados aqui, bem como sondas de modificações de histona epigenética, lamin e nucleoporinas. Notamos que o protocolo também pode ser usado para testículos larvais, nesse caso o heptano deve ser omitido, pois torna os testículos mais difíceis de recuperar intactos.
O protocolo é especialmente projetado para manter pilhas não danificadas dos espermatocitototos juntos para uma rotulagem eficiente e uniforme dos testis. Ilustramos o protocolo com os grandes espermatotozóides em estágio tardio, cujos núcleos disformes os tornam entre as células mais difíceis de preservar. Além disso, nestes espermatotozóides a rotulagem nuclear muitas vezes se torna diluída provavelmente devido ao tamanho dos núcleos. Por exemplo, é comumente observado que a rotulagem de dapi ou lamin é mais forte nas células no ápice testis e se torna progressivamente mais fraca e dispersa à medida que os espermatocitototodos estão crescendo3,24. Essa também pode ser uma das razões pelas quais a distribuição de nucleoporinas só foi descrita em células estágios anteriores (espermatogonia e espermatocitocides precoces)17.
Excelentes imagens de imunostaining de espermatos Drosophila S5 foram publicadas, particularmente para o t-BRD específico e proteínas dany25,26 usando um protocolo de desoxicolato de sódio de 0,3% ou após a esmagamento do tecido21,22. Em nossas mãos, as abóboras levam a uma significativa não uniformidade de coloração nas profundezas do órgão e também sacrificando a estrutura 3D. Mesmo que o uso de desoxicolato de sódio de 0,3% tenha dado melhores resultados, ainda observamos a não uniformidade. Assim, preferimos nP40 por sua reprodutibilidade e qualidade de rotulagem. As imagens confocrizadas permitem a reconstrução de imagens 3D para proteínas nucleares. Por exemplo, aplicamos com sucesso este método usando muitas sondas diferentes, ilustradas aqui pelo domínio mint intranuclear, intimamente associada com as massas de cromatina autossômica e a rede de poros nucleares. A intrigante distribuição 3D dos poros nucleares desses núcleos de espermatocitocito está agora disponível para estudos posteriores. As imagens permitem quantificação reprodutível de colocalização de diferentes espermatotocitos dos mesmos testículos e de diferentes testículos. Pelo que sabemos, esta é a primeira vez que a quantificação precisa pelo coeficiente de correlação de Pearson foi medida em tais amostras. Dá a confiança necessária para a comparação precisa dos níveis de proteína imunolabelled de diferentes testículos.

Os testículos de drosophila são um modelo valioso para o estudo da arquitetura nuclear. Em células espermatogoniais mitóticas, o volume nuclear é em grande parte ocupado por cromatina. Essas células passam por quatro rodadas de divisão, produzindo um cisto de 16 espermatos primários. Nos dias seguintes, os espermatocitos passam por 6 estágios de desenvolvimento (S1-S6), aumentando consideravelmente em volume, aproximadamente 20vezes 1,2. Eles também mudam sua morfologia nuclear. O contorno do núcleo, revelado pelo lamin Dm0, torna-se irregular e mostra profundas invaginações1,3. Isso é acompanhado por extensas alterações de expressão genética e modificações na organização cromatina1,4,5,6,7. Os cromossomos interfásicos são bem definidos no estágio S4-S5, formando três massas distintas correspondentes aos 2 principais autossomos bivalentes e o par X-Y ancorado com o nucleolus.
Mad1 foi originalmente isolado como um componente-chave do ponto de verificação mitótico (revisado em8). Na interfase, é descrito como localizado principalmente no envelope nuclear, mas também no nucleoplasma9,10,11. Em Drosophila testis, relatamos que Mad1 é proeminente no nucleoplasma, intimamente associado com as duas principais massas de cromatina autossômica e em menor grau com a cromatina XY. Definimos esta estrutura associada à cromatina como MINT (Território IntraNuclear contendo Mad1)12. Quatro outras proteínas foram associadas com MINTs em espermatotos: o nucleoporina Mtor/Tpr, o SUMO peptidase Ulp1, a proteína de checkpoint mitotístico Mad2 e uma subunidade de um complexo de Policomb Raf212.
Para completar a descrição dos MINTs, precisávamos usar anticorpos e fomos confrontados com os problemas técnicos geralmente encontrados com imunostendências em testículas: uma má permeabilidade resultando em uma significativa não uniformidade da coloração na profundidade dos testítes, particularmente nos grandes espermatocitos. Aspreparações anuladas aumentaram o acesso a anticorpos, mas levaram a imagens compactadas, restringindo as análises 3D e impedindo a medição da fluorescência quantitativa, incluindo a colocalização. O problema da penetração de anticorpos também poderia ser resolvido por agentes permeabilizadores como 0,3% Na desoxicolato13,mas este procedimento não resultou em nossas mãos resultados reprodutíveis. Como realizamos muitos experimentos de co-rotulagem, procuramos melhorar o protocolo de permeabilização. A combinação de 1% NP40 mais heptano resultou em mais reprodutibilidade, particularmente no estudo dos grandes espermatos.
Este protocolo realiza a fixação e a imunostenção de testículos na suspensão, melhorando a qualidade da amostra, bem como melhorando a reprodutibilidade, e tornando-a adequada para microscopia confocal. Usamos o protocolo para definir melhor as relações espaciais de certas proteínas de envelope nuclear com as estruturas nucleoplasmáticas de grandes espermatotos. Esse método permitirá melhores investigações das mudanças que acompanham o desenvolvimento de espermatotocitos, como por exemplo as dinâmicas mudanças estruturais do núcleo, incluindo cromatina, nucleoplasma e os poros nucleares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Drosophila srains</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mad1-GFP</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>J Cell Sci. 2011 May 15;124(Pt 10):1664-71.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Mtor RNAi&#160;</td>
			<td style="width:129px;">VDRC</td>
			<td style="width:93px;">ID 110218</td>
			<td>Vienna Drosophila RNAi Center</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Materials</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:277px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock solution must be prepared in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dumont # 5 Fine Forseps&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MBP Wide Bore Pipette Tips</td>
			<td style="width:129px;">Fisherbrand</td>
			<td>11917744</td>
			<td>Wide aperture tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific&#160;0.2 mL Individual Tube</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>AB-0620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml micro centrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T3531-200EA&#160;</td>
			<td>Siliconized 2ml tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citifluor AF1</td>
			<td style="width:129px;">Citifluor</td>
			<td>AF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dakopen&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">Z377821-1EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>NS02L-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 4%</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148-500G&#160;</td>
			<td>Paraformaldehyde (4%) dissolved in PBS 1X&#160;; aliquot by 600 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td>14190094</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&#160;</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td></td>
			<td>PBS 1X&#160; containing 0.1% (0.2 % or 0.3%) Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100, for molecular biology,&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GFP booster</td>
			<td style="width:129px;">Chromotek</td>
			<td>gba488</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Mtor</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/40 gift from J. Johansen, Iowa State University</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat anti-Nup62</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:505px;">1/200 gift from H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guinea-pig anti-Ulp1</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Rabbit anti-Raf2</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/200 gift from C. P. Verrijzer, Erasmus University, Rotterdam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DyLight conjugated series&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Thermo</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>1/500 Donkey anti-(guinea-pig, mouse,&#160; rabbit or rat) as second antibodies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining of whole-mount drosophila testes for 3d confocal analysis of large spermatocytes

Os testículos de drosophila são um poderoso sistema modelo para estudar processos biológicos, incluindo biologia de células-tronco, arquitetura nuclear, meiose e desenvolvimento de espermatozoides. No entanto, a imunolabelação de todo o teste de Drosophila é frequentemente associada com significativa não uniformidade da coloração devido à penetração de anticorpos. As preparações esmagadas só superam parcialmente o problema, pois diminui a qualidade 3D das análises. Aqui, descrevemos um protocolo de montagem inteira usando NP40 e heptano durante a fixação, juntamente com a imunolabelagem em mídia líquida. Preserva o volume adequado para microscopia confocal juntamente com rotulagem reprodutível e confiável. Mostramos diferentes exemplos de reconstituição 3D de núcleos espermatocitocitos de seções confocal. A reprodutibilidade intra e inter-testes permite quantificação 3D e comparação da fluorescência entre células únicas de diferentes genótipos. Utilizamos diferentes componentes da estrutura de MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1), bem como dois componentes associados ao complexo de poros nucleares para ilustrar este protocolo e suas aplicações nas maiores células dos testis, os espermatozoides S4-S5.

O principal obstáculo para a obtenção de uma coloração adequada dos testículos de Drosophila é a penetrabilidade limitada dos anticorpos, que foi parcialmente resolvida por meio de preparações esmagadas, mas ao custo de induzir uma restrição das análises 3D (por exemplo, representação 3D ou medida de colocalização). O procedimento permite rotulagem uniforme e preserva o volume de todas as células do testis. Aqui focamos a ilustração do método na representação 3D dos espermatos S4-S5, pois são as maiores células e, portanto, mais sensíveis à deformação da abóbora. Utilizamos diferentes marcadores nucleares, incluindo nucleoporinas e a rotulagem do domínio MINT intranuclear (Território Intra Nuclear Contendo Mad1) descrito pela proteína mitótica Mad112. Como os MINTs poderiam ser revelados por vários anticorpos diferentes, nós os usamos para testar a robustez do protocolo para colocalização quantitativa 3D, um método que requer uma resolução espacial correta.
O protocolo descrito acima permite a aquisição de imagens confocal de qualidade suficiente para então ser tratada para a reconstituição 3D. Quatro seções seriais adjacentes de um espermatodo estágio S5 são retratadas na Figura 1A, mostrando um imunostaining representativo de MINT (Imunolabeling Mad1 usando propulsor GFP em vermelho) juntamente com DAPI (em ciano). Os cromossomos são organizados nos 3 principais aglomerados distintos e a estrutura MINT é mostrada em detalhes finos em torno do DNA, intimamente associada com - mas distinta - as massas de cromatina autossômica. A resolução também permite a detecção da presença de Mad1 na periferia nuclear, bem como entre as massas autossômicas dos cromossomos 2 e 3. Usamos o software Imaris para a representação 3D. A superfície nuclear foi definida pela presença de baixo nível de Mad1 no envelope nuclear (em cinza) e MINT foi definida pelo acúmulo de alto nível de Mad1 dentro do núcleo (em vermelho) juntamente com a coloração DAPI (em azul) (Figura 1A). O filme de reconstituição 3D ilustra bem o volume e a relação de Mad1 (no envelope nuclear e na HORTELÃ) juntamente com os cromossomos no estágio S4-S5 espermatotozóides.
A distribuição de nucleoporinas só tem sido mal descrita nessas células, provavelmente devido à dificuldade em detectá-las nesses grandes núcleos disformes. A distribuição de Nup154 só foi relatada uma vez anteriormente16 e Nup153 e Nup98 foram apenas estudados nos espermatogonias e pequenos espermatos17. As reconstituiçãos 3D de grandes espermatotozóides S5 manchados pela nucleoporina Nup62 e pela importação β (produto do gene ketel) eram viáveis e estão representadas na Figura 1C e Figura 1D,respectivamente. Estes componentes nucleares associados aos poros parecem não uniformemente distribuídos sobre a borda nuclear como pontos de tamanho irregular. Por exemplo, a importação β se reúne em torno da cromatina autossômica da mesma forma que a rede lamin já foi descrita3. Esse tipo de distribuição com áreas ricas em poros e grandes áreas livres de poros foi descrita por microscopia eletrônica em espermatotodos de roedores18. Entender as mudanças na distribuição de lamin e nucleoporina ajudaria a entender a estrutura do envelope nuclear nessas células G2 pouco antes da meiose masculina.
Ao conservar o volume 3D das células, este protocolo também permite que anticorpos penetrem uniformemente na profundidade de cada célula, permitindo análises quantitativas como a colocalização. O coeficiente de correlação de Pearson (PCC) é uma métrica bem estabelecida. Pode variar de +1 (denotando correlação positiva perfeita) a −1 (correlação negativa perfeita)19. Para avaliar a localização de proteínas parceiras MINT em relação ao Mad1 em espermatocitotos, estimamos anteriormente o PCC em uma única seção de 0,5 μm usando ImageJ em espermatos S512 (Figura 2A,B). Testamos o protocolo mais profundamente usando colocalização 3D em todos os núcleos em vez de apenas uma superfície. O volume dos núcleos foi definido por segmentação manual e o PCC foi medido utilizando a ferramenta Colocation. Analisamos oito núcleos de espermatocitocitos S5, dos mesmos testículos ou testículos diferentes. A Figura 2B mostra uma representação 3D de um núcleo que serviu para medir o PCC. A Figura 2D mostra a medição do PCC em oito diferentes núcleos de espermatocetocito S5 de três testículos diferentes. Os valores do PCC não são diferentes, variando de 0,6 e 0,75, indicando um alto valor para a colocalização. Estes são indistinguíveis do PCC definido em uma única seção. Assim, o procedimento permite uma rotulagem uniforme reprodutível e preserva um bom volume de todas as células do testío.
Como o protocolo permite uma medição confiável da colocalização a partir de testículos independentes, permitiu a comparação da coloração de diferentes genótipos de moscas. Isso foi ilustrado aqui por comparação de moscas e moscas WT RNAi esgotadas para Mtor (gerada pela expressão das linhas dsRNA UAS e o driver Bam-Gal4 que alcançam esgotamento substancial em espermatogonia tardia e espermatotosprecoces 20). Como descrito para os experimentos de colocalização, testículos e testículos de tipos selvagens foram dissecados e fixados em conjunto e as imagens confocal foram adquiridas em cenários constantes. Respeitando essas condições, a comparação de células individuais torna-se possível. Observamos que o MINT é mais afetado do que o envelope nuclear pela perda de Mtor, como mostra o representante Mtor RNAi-esgotado (superior) e wt (inferior) células(Figura 3)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração de imunostaining de núcleos de espermatotocetos Drosophila S4-S5 usando diferentes sondas. (A) Imagens de um núcleo de espermatocitocitocoso estágio único 5 imunossumou com anticorpo α-GFP (booster GFP) detectando a estrutura MINT por Mad1-GFP (vermelho) juntamente à coloração DAPI (azul). Mostra com precisão a relação entre Mad1 e as duas massas de cromatina autossômica (representadas como asteriscos). Mad1 também é levemente detectado na periferia do núcleo. Todas as imagens são projeções Z em série de uma pilha de 3 (0,5 μm) de fatias confocal sucessivas. As imagens confocal foram adquiridas em um microscópio confocal (63x, Plan Apochromatic oil DIC objective lens). Barras de escala são 5 μm. (B) Quadro de uma renderização de filme do mesmo núcleo espermatocyte. A superfície nuclear foi definida pela baixa expressão de Mad1 no envelope nuclear (em cinzas) e a MINT foi definida pela alta expressão de Mad1 dentro do núcleo (em vermelho). (A, B) Reimpresso com permissão de figura publicada anteriormente (a partir de12). (C) imagem 3D de um núcleo de espermatocitocito estágio 5 com imunostaining simultânea de Nup62 (amarelo) e MINT (propulsor GFP em vermelho). A barra de escala é de 4 μm. (D) imagem 3D de um núcleo espermatocyte estágio 5 com imunostaining simultânea da importação-β Ketel (amarelo) juntamente com DNA (DAPI em azul). As barras de escala são de 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig02.jpg"> Figura 2: Quantificação de colocalização 2D e 3D de Mad1 juntamente com Ulp1. (A) Imagens mescladas de um núcleo de espermatocitocitos estágio 5 imunossuados com anticorpo de reforço GFP detectando Mad1 (verde) e com anticorpo anti-Ulp1 (vermelho) representado como uma pilha de 1 μm de espessura de um núcleo de espermatocitocitado. À direita é indicado o coeficiente de correlação de intensidade de Pearson calculado usando o plugin Coloc-2 ImageJ. O PCC foi estimado em 0,73 (Reimpresso com permissão de Raich12). (B) Imagem mesclada do núcleo espermatocyte estágio 5 (correspondente ao núcleo G na tabela adjacente) imunossuada com anticorpo de reforço GFP detectando Mad1 (verde) e com anticorpo anti-Ulp1 (vermelho) representado em uma projeção 3D. O volume do núcleo foi definido por segmentação manual. À direita, a tabela lista os coeficientes de correlação de intensidade de Pearson calculados em 8 espermatos diferentes (A a H) de 3 testículos diferentes (1 a 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61061/61061fig03.jpg"> Figura 3: Análise de imunofluorescência de espermatos tratados com Mtor RNAi em comparação com o tipo selvagem. Células esgotadas de Mtor usando células MtorRNAi (ID 110218) (painéis superiores) e células do tipo selvagem (painéis inferiores) foram manchadas para proteínas Mad1, Raf2 e Mtor. Os testículos foram fixados e manchados juntos, montados no mesmo slide e imagens adquiridas com os mesmos parâmetros. As células RNAi poderiam ser distinguidas da TT pela ausência ou presença, respectivamente, de Mad1-GFP. O valor é representativo de projeções máximas de pilhas de 4 x 0,5 μm. A barra de escala é de 5 μm (Reimpressa com permissão de figura publicada anteriormente em12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61061/61061fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

4.1K visualizações.  Université de Paris, F 75006, Paris, France. Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Vídeo: Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...