我々は、新興ウイルスおよびアルボウイルスのための世界参照センター(WRCEVA):ロバート・テッシュ博士、ヒルダ・グスマン、ケネス・プランテ博士、ジェシカ・プランテ博士、ディオンナ・シャルトン、ディヴィヤ・ミルチャンダニ博士が、私たちの他のグループのベクター能力実験に使用されるウイルス株の多くをキュレーションし、提供するたゆまぬ努力をしていることを認めます。提示された作品は、マクラフリン・フェローシップ・ファンド(SRA)とNIH助成金AI120942とAI121452によって資金提供されました。

これらのプロトコルで行われたすべての手順は、ガルベストンのテキサス大学医学部の機関バイオセーフティ委員会および制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに完全に準拠して実行されました。
1. VERO細胞でZIKVを増幅
<ol><li>10%v/v熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)と1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシン(100 U/mLおよび100 μg/mL)を補ったイーグルの最小限の必須培地(DMEM)の変更でベロ細胞(CCL-81またはVeroE6)を成長させる それぞれ)150 cm2組織培養フラスコにおいて5%CO2を有する加湿された37°Cインキュベーターで、合流率80~90%の間に。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネット(BSC)では、培地を取り出し、10%漂白剤または二重第四級アンモニウムのワーキング希釈(材料表)で処分する。1 mLのウイルスストックで即座に単層を接種し、細胞当たり0.1-1の感染性ウイルス粒子を目指します。接種物が単層全体に接触するように、フラスコを直ちに攪拌する。</li>
	<li>2%v/v熱不活化FBS、および1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMを使用して、培地を5 mLのボリュームに上げてください。その後、フラスコを加湿した37°Cインキュベーターに5%CO2で60分間移動させます。</li>
	<li>インキュベーターからフラスコを取り出し、BSCに持ち込みます。2%v/v熱不活性化FBS、および1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンを補ったDMEMを使用して、合計体積15 mLに培地を追加します。フラスコを5%CO2の加湿37°Cインキュベーターに移します。</li>
	<li>細胞性効果(CPE)の証拠について、相コントラスト顕微鏡で毎日フラスコを調べます。細胞の約40〜50%のみが単層に残っている場合はウイルス収穫(ステップ1.7)に進み、一般的に利用されているZIKVの菌株に応じて感染後3〜5日。</li>
	<li>上清を吸引し、50 mLの円錐バイアルに入れる。遠心分離(3,500 x g) で細胞デブリの上清を明らかにする。 注:複数のフラスコが同じように感染した場合、複数のフラスコの上澄み物を50 mLの円錐形チューブに組み合わせることができます。</li>
	<li>50 mLの円錐形チューブから新鮮なチューブに上清を取り出し、ペレットを破壊しないように注意してください。熱不活化FBSで上清を30%(v/v)の最終濃度に補います。アリコートこの混合物を個々のスクリューキャップチューブにし、使用するまで-80°Cで凍結します。</li>
</ol>2. 人工血液の調製
<ol><li>蚊が感染性の血液を受ける日には、蚊が曝露する準備が整うまでに、栄養ユニット(材料表)が予熱されるように、節足動物の封じ込め施設の電源(材料表)をオンにします。</li>
	<li>以下に説明する方法の1つを用いて人工血液食事を調製する。<ol>
<li>方法1:市販の1:1 v/vで購入した、採取したばかりの(1週間以内)、またはヘパリン化されたヒト血液をウイルスストック(セクション1に記載されているように調製)と組み合わせる。 注:この方法は、血液中に存在するウイルス/ウイルスファミリーに対する抗体がないことに依存します。</li>
		<li>抗体の不存在が確認できない場合、または血液源が以前のフラビウイルス暴露を有することが知られている場合は、赤血球を洗浄して手動でパックする。<ol>
<li>BSCでは、50 mLの円錐管に全ヒト血液の30 mLを加え、リン酸緩衝生理食塩基(PBS)で最大50mLを上げる。</li>
			<li>20分間3,500 x g の遠心分離機。</li>
			<li>上清を吸引するか、10%漂白剤を含むトレイパンにやさしく注ぐか、または二級アンモニウムの希釈を働かせ、赤血球ペレットを捨てないように注意する。</li>
			<li>PBSを10mL加え、赤血球ペレットが再構成されるようBSCの底部に対して円錐管の底部を軽くタップします。懸濁液の容積をPBSで50mLまで持って来なさい。優しい反転で混ぜます。</li>
			<li>ステップ 2.2.2.1-2.2.2.4 を合計 4-6x 繰り返します。上清が透明であるか、わずかにピンク色で不透明でなくなったことを確認します。血清ピペットを使用してすべての上清を除去します。1-2 mLのPBSで赤血球ペレットを再懸濁します。</li>
			<li>血液を組み立てる:パック赤血球の350 μL、10%スクロースの100 μL、熱不活性化FBSの200 μL、900 μM組換えATP、およびDMEMを使用して適切に希釈されたウイルスストックの2 mLを2%v/vヒートインFBS、および1%(vペンコシン)ストリンスチンを組み立てます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染していないマウスの皮膚と標準3 mLリザーバユニット(材料表)を重ね合わせ(他のオプションには、パラフィン膜、コラーゲン膜、またはソーセージケーシングが含まれます)。</li>
	<li>白いペーパータオルの上に覆われた貯水池を置きます。一度に1mLのリザーバに感染性の血液ミールの〜2 mLを加えます。フィーダーの下のタオルを点検して、漏れの証拠がないか確認します。漏れが存在する場合は、フィーダーから血液を回収し、カバーを廃棄します。フィーダーをプラグで密封します。リークが存在しない場合は、もう一度確認してください。</li>
</ol>3. 血液の食/プラークアッセイのバックティトレーション
<ol><li>調製された血液ミールの残りの体積を使用して、DMEMを2%v/v熱不活性化FBS、および1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンを補って、10xシリアル希釈シリーズ(すなわち、希釈された10倍から1,000,000xまでの範囲の6つの希釈)を行う。</li>
	<li>最も希薄から最も濃縮までの24または12ウェルプレートのウェルに希釈のアリコート100 μL。</li>
	<li>37°C、5%CO2インキュベーターで1時間インキュベートする。</li>
	<li>1時間のインキュベーション期間の終わりに、プレートをBSCに戻し、メチルセルロースオーバーレイの1mLまたは2mLを24ウェルまたは12ウェルプレートに追加します。</li>
	<li>オーバーレイされたプレートを37°C、5%CO2インキュベーターに戻し、3〜7日間インキュベートします(ウイルス株依存)。</li>
	<li>インキュベーターに続いて、インキュベーターからプレートを取り出し、BSCに持ち込む。メチルセルロースオーバーレイを10%漂白剤または二級四級アンモニウム消毒剤を含むトレイパンに捨てます。</li>
	<li>PBSで各ウェルを2倍洗い、10%漂白剤または二重四級アンモニウムを含むトレイパンに洗浄を捨てます。</li>
	<li>メタノール:アセトン(1:1 v:v)の〜1 mLを加え、細胞が室温(RT)でBSCで少なくとも30分間プレートに固定できるようにします。有機廃棄物に関する制度方針に従ってメタノール:アセトンを廃棄する。</li>
	<li>以下に説明する 2 つの方法のいずれかを使用して、ZIKV を視覚化します。<ol>
<li>メタノール:アセトンの除去に続いて、5分間の結晶バイオレット溶液(0.25%w/v 30%メタノール中の0.25%w/v)ですぐに染色する。水道水で2倍をすすいで乾燥させ、プラークまたは単層の破壊の証拠を目で直接視覚化します。</li>
		<li>あるいは、フォーカス形成アッセイを行う。<ol>
<li>有機固定剤が残らないまでプレートを空気乾燥させます。 注:これはBSCの外に〜2-3時間かかるはずですが、BSCまたは化学発煙フードで空気乾燥することによって加速することができます。</li>
			<li>軌道プレートロッカーで、各ウェルを15分間無菌PBS(Mg2+ およびCa2+ フリー)で洗浄します。PBSを取り除き、各ウェルに1mLのブロッキング溶液(PBS + 3%FBS)を加え、RTで15分間ロックします。</li>
			<li>α-ZIKVまたはα-フラビウイルス一次抗体(例えば、フラビウイルス群ハイブリドーマD1-4G2-4-15[4G2])のウェルあたり100 μLをブロッキング溶液に1:2,000希釈して添加します。RTで最低4時間(好ましくは一晩、18時間を超えない)のロッキングでインキュベートする。</li>
			<li>一次抗体を取り出し、軌道プレートロッカーでPBS(Mg2+ およびCa2+ フリー)をそれぞれ15分間洗浄します。</li>
			<li>2次抗体(ラットαマウスHRP標識)のウェルあたり100 μLを加えて、ブロッキングバッファーで1:2,000希釈します。RTで1時間ロッキングでインキュベートします。</li>
			<li>軌道プレートロッカーにPBS(Mg2+ とCa2+ 無料)を使用して、それぞれ15分間3倍洗浄します。</li>
			<li>アリコート100 μLの基質開発試薬(材料表)1ウェルあたり。RTで15分間のロックプレート。</li>
			<li>基質を取り除き、プレート2xを水道水ですすいで、病巣/プラークの発生時の反応を停止します。水道水を注ぎ、プレートを空気乾燥させてから定量化します。</li>
			<li>ウイルス病巣を数えて、与えられたサンプルに存在するFFUの数を決定する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 献血の管理
<ol><li>Ae.アエジプティ蚊は、エブロセクション後2〜4日使用してください。スクリーニングされた蓋を持つ0.5 L段ボールカートンにメスの蚊を分類し、砂糖を奪う(一般的に感染性の血液粉の前に36-48時間)。水飽和綿球を介してアドリビタム水を提供します。</li>
	<li>蚊が感染性の血液粉にさらされる朝に水飽和綿のボールを取り除きます。</li>
	<li>透明なプラスチック製のグローブボックス内の給餌ユニットリードに人工の血液を含む貯水池を取り付けます。</li>
	<li>グローブボックス内に、50-100の飢えた Ae.aegypti 蚊を含むスクリーニングされた蓋付きの0.5 L段ボールカートンを、貯水池に取り付けられた給餌ユニットの下に置きます。 注:適切に飢えた蚊は、通常20分以内に餌を与えます。(ZIKV)ウイルス価が~60分後にフィーダー内で減少する可能性があるため、摂食は、遅い集団でサンプルサイズを増加させるために必要に応じて延長することができますが、これは60分を超えて伸びるべきではありません。</li>
	<li>給餌が完了したら、リザーバーを取り出し、作りたての10%漂白剤に浸します。</li>
	<li>-20°Cで30s、または冷蔵庫で5分間インキュベーションして蚊を冷たい麻酔をします。</li>
	<li>グローブボックス内で、氷の上のペトリ皿に蚊を注ぎます。アンエンゴーグ蚊から魅惑的なメスを数え、並べ替えます。70%エタノールで満たされた50 mLチューブ円錐管に浸漬して、未エングールド蚊を処分する。蚊がまだ麻酔されている間、0.5 L段ボールカートンに戻し、すぐに画面と蓋で覆います。カートンの余分な画面メッシュをトリミングし、テープでメッシュを固定します。</li>
	<li>各カートンのスクリーンに滅菌濾過10%のスクロースで飽和した綿球を加えます。湿度を維持するために湿ったスポンジと大きなプラスチック二次容器にすべての蚊のカートンを置きます。</li>
	<li>蚊のカートンを含む二次容器を、相対湿度10 ±%、16:8の光:暗いサイクルで、温度27±1°C(または関心領域の条件をシミュレートするのに適切な場合)のインキュベーターに入れます。実験が完了するまで、10%のスクロースへの アドリビタム アクセスで蚊を維持します。</li>
</ol>5. サンプルの取得と処理
<ol><li>指定された日のポスト給餌では、グローブボックス内の機械的吸引器を使用して適切なカートンから所定の数の蚊を吸引する。必要な数の蚊が獲得された後、綿を丸く収集管にキャップします。</li>
	<li>蚊を-20°Cで30秒間、または4°Cで5分間潜伏して蚊を冷たい麻酔をします。</li>
	<li>グローブボックス内で、氷の上のペトリ皿に蚊を注ぎます。2組の鉗子を使用して、各蚊の脚6本すべてを取り除き、滅菌されたステンレス鋼のボールベアリング(7/32")と500μLの蚊収集メディア(MCM)を含む事前にラベル付けされた2 mL底マイクロ遠心分離チューブに入れます。</li>
	<li>蚊をミネラルオイルの滴にそっと置いて抑制し、油と蚊の頭とプロボシスとの接触を許さないように注意してください。</li>
	<li>10 μL の熱不活化 FBS を充填した 10 μL ピペットチップに蚊のプロボシスを挿入します。 注:または、ピペットは、スクロース、血液、またはミネラルオイルで満たすことができます。オイルは軽い顕微鏡によって唾液泡の直接視覚化を可能にする。</li>
	<li>蚊に30分間唾液を入れるようにします。FBS + 唾液を含むマイクロピペットチップを100 μLのMCMを含むマイクロ遠心分離管に排出し、滅菌されたスチールボールベアリングと500 μLのMCMを含む別の2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに死体を入れます。体、脚、唾液に使用されるチューブにラベルが付いていることを確認して、3つのサンプルすべてが同じ蚊から発生したものであることを確認します。</li>
	<li>蚊が唾液を吐いている間に、残りの蚊にステップ5.3-5.5を実行します。</li>
	<li>ボディと脚を含むチューブをBSC内に含まれるビーズの粉砕組織均質化装置に輸送する。ウイルス粒子を上清に解放するために、26 Hzですべての体と脚のサンプルを5分間トリチュレートします。細胞の破片をペレットに5分間200 x g で遠心分離してすべてのサンプルを明らかにする。 注:この時点で、サンプルは-80°Cで凍結するか、すぐにアッセイすることができます。</li>
</ol>6. 感染アッセイによるZIKVの検出
<ol><li>BSCでは、感染性アッセイの発症前に、ベロ細胞(ウェルあたり105 細胞あたり10個の細胞)を用いて24の組織培養プレートを調製する。各々のラベルには、単一の蚊/サンプルのアイデンティティが付いています。</li>
	<li>サンプルを-80°Cで凍結した場合は、解凍を行う。</li>
	<li>一度に1プレートずつサンプルを接種する前に、ベロ細胞プレートから培地を取り出します。</li>
	<li>体や脚を含むサンプルの場合、ペレットから蚊の細胞の破片を邪魔しないように注意して、各ウェルに清澄化上清の100 μLを慎重にアリコートします。 注:唾液サンプルは、必要に応じて、後の滴定のためにサンプルを保存するために細胞に接種する前にMCMで1:1(v/v)希釈することができます。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2インキュベーターに移動し、1時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートをBSCに戻し、各ウェルにメチルセルロースオーバーレイの〜1 mLを追加します。オーバーレイしたプレートを37°C、5%CO2インキュベーターに戻し、3-7日間インキュベートします(ウイルス/歪み依存)。</li>
	<li>ステップ 3.6-3.9 の説明に従って、固定と視覚化を実行します。</li>
	<li>焦点形成アッセイによる採点に関しては、光顕微鏡で検査することで正のウェルを定量化する。ウェル内の細胞の細胞内染色の検出は、ウイルスの存在を示す。サンプルは、フォーカスポジティブまたは-負としてスコア付けされます。</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する方法は、ベクトル能力分析を行う一般化されたワークフローを提供します。一般的な枠組みとして、これらの方法論の多くは文献全体に保存されています。しかし、変更の余地は大きくあります(AzarとWeaver1でレビュー)。ウイルス(例えば、ウイルス系統、チャレンジウイルスの保存、ウイルス通過歴)、昆虫学(例えば、蚊集団の実験室コロニー形成、先天性免...

ベクター能力は、種、集団、さらには個体のレベルでの能力として定義され、蚊、ダニ、またはフレボトミン砂飛のような与えられた節足動物の、節足動物1,2における複製または発生を伴う生物学的に薬剤を取得および伝達する。蚊および節足動物媒介ウイルス(すなわち、アルボウイルス)に関して、薬剤は雌の蚊によってビレミック宿主から浸透する。摂取後、ウイルスは、消化酵素によるタンパク質分解分解、微生物叢(ミドグ感染障壁、またはMIB)の存在、および分泌された腹膜マトリックスなどの様々な生理学的障害を克服し、中腸上皮細胞3の小集団の1つに生産的に感染しなければならない。中腸上皮の感染は、ウイルスの複製と最終的に蚊の開放的な循環系への中腸からの脱出、または中腸脱出障壁(MEB)を克服する播種感染の発症を表す血中リンパに続かなければならない。この時点で、ウイルスは二次組織(例えば、神経、筋肉、脂肪体)の感染を確立し、複製を続けることができますが、そのような二次複製は、ウイルスが唾液腺の体内細胞に感染する(唾液腺感染障壁を克服する)ために厳密に必要ではないかもしれません。唾液腺から補助的な空洞への出射口から唾液管への移動は、噛み付きの後続の宿主へのウイルスの接種を可能にし、伝達周期1、2、4、5、6、7を完了する。
このよく特徴づけられ、一般的に蚊ベクター内に広がるメカニズムが一般的に保存されていることを考えると、実験室のベクター能力評価はしばしば方法論的に類似しているが、プロトコルの違いは1,2である。一般的に、経口ウイルス暴露後、蚊は、ウイルス感染、播種感染、感染/潜在的なトランスリアル感染、および感染/潜在的な感染能力をそれぞれ8回受精させるため、中腸、脚、卵巣、唾液腺などの個々の組織をアッセイできるように解剖される。しかし、唾液腺にウイルスが存在することは、唾液腺脱出/出口バリア(SGEB)の証拠を与えられた1、2、4、5、7、9の伝達能力の決定的な証拠ではない。伝染能力を証明する標準的な方法は、感染の影響を受けやすい動物10、11、12への蚊の伝染のままである。しかし、多くのアルボウイルスでは、免疫不全マウスモデル13、14、15、16の使用が必要であることを考えると、この方法はしばしばコストが非常に高い。一般的に使用される代替手段は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)または感染性アッセイによって分析することができる蚊の唾液の採取であり、それぞれウイルスゲノムまたは感染性粒子の存在を実証する。このようなインビトロ唾液採取方法は、生体内給餌中に堆積したウイルスの量を12個過大評価または過小評価する可能性があり、そのようなデータは慎重に解釈しなければならないことを示している。しかし、インビトロ法は唾液中のウイルスの存在の観点から分析した場合に非常に価値が高く、感染の可能性を示す。
アルボウイルス性疾患の発生における蚊ベクターの役割を決定するための2つの主要なアプローチが存在する。最初の方法は、活動的な伝達18、19、20、21、22、23、24のコンテキストで蚊が収集されるフィールド監視を含みます。しかし、感染率が典型的には非常に低い(例えば、米国21の活動性ジカウイルス(ZIKV)循環地域における蚊の推定0.061%感染率)を考えると、潜在的な種の犯罪は、方法論25、26およびランダムな確率(例えば、1,600人の感染した個人をサンプリングする)によって大きく偏る可能性がある。.これを考慮して、特定の研究は、伝染に関与する蚊を正確にサンプリングするのに十分な生の数または種の多様性の両方で十分な蚊を獲得しない可能性があります。対照的に、ベクター能力分析は実験室で行われ、経口投与などのパラメータを厳密に制御することができます。蚊の感染と伝染能力の真の複雑さをフィールド環境で完全に表す能力はありませんが、これらの実験室評価はアーボビロ学の分野で強力なツールのままです。
いくつかの蚊種、集団、および方法27、28、29、30、31、32の様々なベクトル能力分析に基づいて、ベクター能力評価の最近のレビュー1、典型的なベクトル能力ワークフローに関連するプロトコルのいくつかをここで説明する。これらの実験では、南北アメリカ(サルバドール市、ブラジル、ドミニカ共和国、および米国の低リオグランデバレー、TX、米国)からの3つのAe.aegypti集団が、4、5、または6ログ10の焦点形成単位(FFU/m線量)でZIKV(Mex 1-7、GenBank加盟:KX247632.1)の単一株にさらされました。その後、外挿術の様々な時間(2、4、7、10、および14日間)の後に、解剖および細胞培養ベースの感染アッセイによって感染、播種感染、および伝染能力の証拠について分析した。現在のワークフロー/プロトコルはZIKV用に最適化されていますが、多くの要素は節足動物の封じ込めおよびバイオセーフティレベル2および3(ACL/BSL2またはACL/ BSL3)の他の蚊媒介性アルボウイルスに直接翻訳可能です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3mL Standard Reservoir</td>
			<td>R37P30</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#34; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td>
			<td>4RJH9</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Grinding Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A16-P4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>A6419-1G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Primary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td>
			<td>5450-0011</td>
			<td>KPL/Seracare</td>
			<td>Secondary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NC0427256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Decontamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td>
			<td>10-126-34</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>C0775-100G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td>
			<td>13-675-15B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-22</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FU1 Feeder</td>
			<td>FU1-0</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; feeding units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>140-040-182</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&#956;g/mL, 50mL/Bottle</td>
			<td>15-290-026</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td>
			<td>7203706</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>Bloodmeal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InsectaVac Aspirator</td>
			<td>2809B</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &#176;C), 250g/Bottle</td>
			<td>M0512-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td>
			<td>C849T34</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>M5904-5X5ML</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>OR37-25</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Plugs</td>
			<td>PP5-250</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS6 Power Unit (110-120V)</td>
			<td>PS6120</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td>
			<td>4525</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td>
			<td>50-809-242</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&#956;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td>
			<td>21-402-487</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-486</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-484</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-482</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>85300</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td>
			<td>5510-0030</td>
			<td>Seracare</td>
			<td>Developing solution for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

提示された手順は、問題の蚊集団における感染率、播種感染、およびウイルスの潜在的な感染率を決定するために、実験室の条件下で Aedes aegypti 蚊をジカウイルスに感染させる一般的な方法論を記述する。これらの手順は、ベクター能力評価における様々な変更をグローバルに広く利用されています。彼らは、与えられた蚊(すなわち、種、集団、個体)が与えられた薬剤の伝達において果たす可能性のある役割を決定する上で重要である。

Aeの3つの集団。 アメリカ大陸(サルバドール、ブラジル、ドミニカ共和国、およびリオグランデバレー、TX、米国)からの aegypti は、血液をベースにした血液中のチター(4、5、および6ログ10 FFU/mL)の範囲にわたって、アメリカ大陸(ZIKV Mex 1-7、チアパス州、メキシコ、2015)からのZIKVの発生株にさらされました。2日目、4日目、7日目、10日目、14日目に、蚊のサブセットを処理して感?...

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti 蚊集団のベクター能力を決定することができる。

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K ビュー.  University of Texas Medical Branch. 提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti 蚊集団のベクター能力を決定することができる。

ビデオ: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

免疫・感染学

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

ハイブリダイゼーション<em&gt;その場で</em&gt;唾液腺、卵巣、および媒介蚊の胚の

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

ジカ特定診断エピトープの探索

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析