אנו מודים לצוות של מרכז ההתייחסות העולמי לווירוסים מתפתחים ו Arboviruses (WRCEVA): ד"ר רוברט טש, הילדה גוזמן, ד"ר קנת פלנטה, ד"ר ג'סיקה פלנטה, דיון שרטון ודיביה מירצ'נדאני, על עבודתם הבלתי נלאה באוצר ובספקת זנים ויראליים רבים המשמשים לניסויי היכולת הווקטורית שלנו ושל קבוצות אחרות. העבודה המוצגת מומנה על ידי קרן מלגות מקלפלין (SRA) ו- NIH מעניקה AI120942 ו- AI121452.

כל ההליכים שבוצעו בפרוטוקולים אלה בוצעו בעמידה מלאה בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון.
1. להגביר את זיקה מיק"ב בתאי Vero
<ol><li>לגדל תאי Vero (CCL-81 או VeroE6) בשינוי של Dulbecco של המדיום החיוני המינימלי של נשר (DMEM) בתוספת 10% v / v סרום בקר עוברי מומת חום (FBS), ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין (100 U / mL ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) באינקובטור לח של 37 °C עם 5% CO2 עד בין 80−90% conencency בבקבוק תרבית רקמות 150 ס"מ2.</li>
	<li>בארון בטיחות ביולוגית (BSC), להסיר את המדיום ולהיפטר או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול (שולחן החומרים). מיד לחסן את monolayer עם 1 מ"ל של מלאי ויראלי, מכוון 0.1−1 חלקיק ויראלי זיהומיות לכל תא. להסעיר את הבקבוקון מיד כך inoculum יוצר קשר עם monolayer בשלמותו.</li>
	<li>למעלה המדיום לנפח של 5 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן להעביר את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2 במשך 60 דקות.</li>
	<li>מוציאים את הבקבוק מהחממה ומכניסים אותו ל-BSC. הוסף מדיום נוסף לנפח כולל של 15 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. הזז את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2.</li>
	<li>בדוק את הבקבוקון מדי יום תחת מיקרוסקופיה ניגוד פאזה לקבלת ראיות של אפקטים ציטוטופתיים (CPE). המשך לקציר הנגיפי (שלב 1.7) כאשר רק כ 40−50% מהתאים נשארים ב monolayer, בדרך כלל 3−5 ימים לאחר ההדבקה בהתאם לזן של ZIKV מנוצל.</li>
	<li>שאפו את הסופר-טבעי והכניסו למז"ל חרוט 50 מ"ל. להבהיר את supernatant של פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה (3,500 x גרם במשך 20 דקות). הערה: אם צלוחיות מרובות נדבקו באופן זהה, supernatants מבקבוקונים מרובים ניתן לשלב לתוך צינורות חרוט 50 מ"ל.</li>
	<li>הסר את supernatant מן הצינור חרוט 50 מ"ל אחד טרי, דואג לא לשבש את הכדור. להשלים את supernatant עם FBS מומת חום לריכוז הסופי של 30% (v/ v). Aliquot תערובת זו לתוך צינורות כובע בורג בודדים להקפיא ב -80 °C (80 °F) עד השימוש.</li>
</ol>2. הכנת דם מלאכותי
<ol><li>ביום שבו יתושים ייחשפו לדמיכות דם זיהומיות, הפעילו את מקור הכוח (שולחן החומרים) במתקן בלימת פרוקי רגליים, כך שיחידות ההאכלה (שולחן החומרים) יתחממו מראש עד שהיתושים יהיו מוכנים לחשיפה.</li>
	<li>הכן כתמי דם מלאכותיים באמצעות אחת השיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>שיטה 1: שלבו דם אנושי שנקטף טרי (תוך שבוע) שנרכש מסחרית 1:1 v/v עם מלאי ויראלי (שהוכן כמתואר בסעיף 1). הערה: שיטה זו מותנית בהיעדר נוגדנים למשפחת הנגיף/וירוס הנמצאת בדם.</li>
		<li>אם היעדר נוגדנים לא ניתן לאשר או מקור הדם ידוע יש חשיפה פלביוירוס קודם, לשטוף ולארוז באופן ידני אריתרוציטים.<ol>
<li>ב BSC, להוסיף 30 מ"ל של דם אנושי שלם לצינור חרוטי 50 מ"ל ומעל עד 50 מ"ל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).</li>
			<li>צנטריפוגה ב 3,500 x g במשך 20 דקות.</li>
			<li>שאפו את supernatant או על ידי לשפוך בעדינות לתוך מחבת מגש המכיל או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול, דואג לא להשליך את כדורי אריתרוציטים.</li>
			<li>הוסף 10 מ"ל של PBS והקש בעדינות על החלק התחתון של הצינור חרוטי נגד החלק התחתון של BSC, כך גלולה אריתרוציטים כבר מחדש. להביא את נפח המתלה עד 50 מ"ל עם PBS. מערבבים על ידי היפוך עדין.</li>
			<li>חזור על שלבים 2.2.2.1−2.2.2.4 בסך הכל 4−6x. אשר כי supernatant הוא ברור או רק מעט ורוד כבר לא אטום. הסר את כל supernatant באמצעות pipette סרולוגי. resuspend גלולה אריתרוציטים ב 1−2 מ"ל של PBS.</li>
			<li>להרכיב את הדם: 350 μL של אריתרוציטים ארוזים, 100 μL של 10% סוכרוז, 200 μL של FBS מומת חום, 900 מיקרומטר RECOMBINANT ATP, ו 2 מ"ל של מלאי וירוס מדולל כראוי באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיסוי יחידת מאגר 3 מ"ל סטנדרטית(שולחן חומרים)עם עור של עכבר לא נגוע (אפשרויות אחרות כוללות סרט פרפין, קרומים קולגניים, או מעטפת נקניקיות).</li>
	<li>מניחים את המאגר המקורה על מגבות נייר לבן. הוסף ~ 2 מ"ל של דם זיהומיות למאגר 1 מ"ל בכל פעם. בדוק את המגבת מתחת למאכיל לכל ראיה לדליפה. אם קיימות דליפות, יש לשחזר את נקזת הדם מהמזינים ולהשליך את הכיסויים. לאטום את המאכילים עם תקעים. שוב לאשר כי אין דליפות קיימות.</li>
</ol>3. תיוג של קמות דם/בדיקת פלאק
<ol><li>באמצעות הנפח הנותר של קמות הדם מוכן, לבצע סדרת דילול טורי 10x (כלומר, 6 דילול, החל מדולל 10x כדי 1,000,000x) באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>Aliquot 100 μL של דילול לתוך בארות של 24 או 12 לוחות היטב מן מדלל ביותר מרוכז ביותר.</li>
	<li>דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור.</li>
	<li>בסוף תקופת הדגירה של 1 שעות, להחזיר את הלוחות לתוך BSC ולהוסיף 1 מ"ל או 2 מ"ל של כיסוי methylcellulose 24 טוב או 12 לוחות היטב, בהתאמה.</li>
	<li>מניחים צלחות כיסוי בחזרה 37 °C ,5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי זן וירוס).</li>
	<li>לאחר הדגירה, להסיר את הצלחות מן האינקובטור ולהביא לתוך BSC. יש להשליך את כיסוי המתילצלולוז למחבת מגש המכילה 10% אקונומיקה או חומר חיטוי אמוניום דו-צדדי.</li>
	<li>לשטוף כל באר 2x עם PBS, להשליך את לשטוף לתוך מחבת מגש המכיל 10% אקונומיקה או אמוניום quaternary כפול.</li>
	<li>הוסף ~ 1 מ"ל של מתנול:אצטון (1:1 v:v) ולאפשר לתאים לתקן על צלחת לפחות 30 דקות BSC בטמפרטורת החדר (RT). להשליך מתנול:אצטון על פי מדיניות מוסדית על פסולת אורגנית.</li>
	<li>דמיין את ZIKV באמצעות אחת משתי שיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>לאחר הסרת מתנול:אצטון, כתם מיד עם פתרון סגול קריסטל (0.25% w /v ב 30% מתנול) במשך 5 דקות. יש לשטוף 2x במי ברז ולהשאיר לייבוש, ולאחר מכן לדמיין ישירות על ידי העין לראיות של לוחות או הרס של monolayer.</li>
		<li>לחלופין, בצע מיקוד יצירת מעש.<ol>
<li>אפשר ללוחות להתייבש עד שלא יישאר קיבוע אורגני. הערה: זה צריך לקחת ~ 2−3 שעות מחוץ ל- BSC אבל יכול להיות מואץ על ידי ייבוש אוויר BSC או מכסה המנוע אדים כימיים.</li>
			<li>לשטוף כל באר 3x במשך 15 דקות כל אחד PBS nonsterile (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית. הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון חסימה (PBS + 3% FBS) לכל באר וסלע במשך 15 דקות ב RT.</li>
			<li>הוסף 100 μL לבאר של α-ZIKV או α-flavivirus העיקרי נוגדן (למשל, קבוצת flavivirus hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) בדילול של 1:2,000 בחסימת פתרון. דגירה עם נדנדה למינימום של 4 שעות (רצוי לילה, לא יעלה על 18 שעות) ב RT.</li>
			<li>הסר את הנוגדן העיקרי לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.</li>
			<li>הוסף 100 μL לבאר של הנוגדן המשני (עז α עכבר HRP מסומן) מדולל 1:2,000 בחסימה חוצץ. דגירה עם נדנדה במשך שעה ב RT.</li>
			<li>לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (מ"ג2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.</li>
			<li>Aliquot 100 μL של ריאגנט פיתוחמצע (טבלת החומרים)לבאר. צלחות סלע ב RT במשך 15 דקות.</li>
			<li>לעצור את התגובה עם התפתחות של מוקדים / לוחות על ידי הסרת המצע ושטיפה את הצלחות 2x עם מי ברז. יוצקים ממי ברז ומאפשרים לצלחות להתייבש לפני הכימות.</li>
			<li>ספירת מוקדים ויראליים כדי לקבוע את מספר FFU הנוכחי במדגם נתון.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניהול דם
<ol><li>השתמש Ae. aegypti יתושים 2−4 ימים לאחר אקסלוסיה. מיין יתושים נקבות לתוך 0.5 L קרטון קרטון עם מכסים מוקרן לשלול מהם סוכר (בדרך כלל 36−48 שעות לפני מקצית הדם זיהומיות). ספק מי ליביטום עד באמצעות כדורי כותנה רוויים במים.</li>
	<li>הסר את כדורי הכותנה רווי מים בבוקר כי היתושים יהיו חשופים לדם זיהומיות.</li>
	<li>חבר מאגרים המכילים כתמי דם מלאכותיים ליחידת האכלה מוביל בתוך תיבת כפפות פלסטיק שקופה.</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, מניחים קרטון קרטון 0.5 L עם מכסה מוקרן, המכיל 50−100 יתושי Ae. aegypti מורעבים, מתחת ליחידת ההאכלה המחוברת למאגר. הערה: יתושים מורעבים כראוי בדרך כלל להאכיל בתוך 20 דקות. האכלה יכולה להיות ממושכת לפי הצורך כדי להגדיל את גודל המדגם באוכלוסיות איטיות יותר, אם כי זה לא צריך להאריך מעבר 60 דקות, כי (ZIKV) titer ויראלי יכול להקטין בתוך המאכיל לאחר ~ 60 דקות.</li>
	<li>עם השלמת ההאכלה, להסיר את המאגר ולטבול אקונומיקה 10% טרי.</li>
	<li>יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 s ב -20 מעלות צלזיוס או במשך 5 דקות במקרר.</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. לספור ולמיין את הנקבות הספוגות מיתושים לא שקועים. יש להיפטר מהיתושים הלא מנוצלים על ידי טבילה בצינור חרוט 50 מ"ל מלא ב-70% אתנול. בעוד היתושים עדיין מרדים, לשפוך אותם בחזרה לתוך קרטון קרטון 0.5 L לכסות במהירות עם המסך ואת המכסה. חותכים רשת מסך עודפת מהקרטון ומאבטחים את הרשת עם סרט הדבקה.</li>
	<li>מוסיפים כדור כותנה רווי בסורוז מימי ומסונן סטרילי 10% למסך של כל קרטון. מניחים את כל קרטוני היתוש במיכל פלסטיק משני גדול עם ספוג לח כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>מניחים מיכל משני המכיל קרטונים של יתושים לתוך אינקובטור עם טמפרטורה של 27 ± 1 °C (או לפי הצורך כדי לדמות תנאים באזור העניין) עם 80% ± 10% לחות יחסית 16:8 אור:מחזור כהה). שמור על היתושים עם גישה ל-10% סוכרוז עד להשלמת הניסויים.</li>
</ol>5. רכישה ועיבוד לדוגמה
<ol><li>בימים שצוינו לאחר ההזנה, שאף מספר קבוע מראש של יתושים מהקרטונים המתאימים באמצעות שאיפה מכנית בתוך תא כפפות. כובע צינור האוסף עם סיבוב כותנה לאחר מספר היתושים הנדרש נרכש.</li>
	<li>יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 שניות ב -20 °C (5 °F) או במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להסיר את כל שש הרגליים של כל יתוש ומניחים בצינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל המכיל נושאת כדור נירוסטה מעוקרת (7/32) ו 500 μL של מדיה איסוף יתושים (MCM) המורכב DMEM, 2% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 2.5 μg / mL amphotericin.</li>
	<li>מניחים בעדינות את היתוש על טיפת שמן מינרלי כדי לרסן אותו, תוך כדי קבילות שלא לאפשר כל מגע בין השמן לראש היתוש ופרובו-ביס.</li>
	<li>הכנס את פרובוסיס היתוש לתוך קצה פיפטה 10 μL מלא 10 μL של FBS מומת חום. הערה: לחלופין, ניתן למלא את הפיפטה ב סוכרוז, דם או שמן מינרלי. השמן מאפשר הדמיה ישירה של בועות רוק באמצעות מיקרוסקופיה קלה.</li>
	<li>אפשר ליתושים להזיל ריר במשך 30 דקות. להוציא את קצה micropipette המכיל FBS + רוק לתוך צינור microcentrifuge המכיל 100 μL של MCM, ולאחר מכן למקם את הפגר לתוך צינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל נפרד המכיל נושאת כדור פלדה מעוקרת 500 μL של MCM. ודא כי הצינורות המשמשים את הגופים, הרגליים והרוק מסומנים כך שיהיה ברור שכל שלוש הדגימות מקורן באותו יתוש.</li>
	<li>בעוד היתושים הם ריר, לבצע שלבים 5.3−5.5 על היתושים הנותרים.</li>
	<li>להעביר את הצינורות המכילים את הגופים והרגליים למכשיר הומוגניזציה של רקמת כרסום חרוזים הכלול בתוך BSC. תטריאט את כל דגימות הגוף והרגל ב-26 הרץ למשך 5 דקות כדי לשחרר חלקיקים ויראליים לתוך הסופר-נט. להבהיר את כל הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות כדי גלולה פסולת הסלולר. הערה: בשלב זה, דגימות ניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F), או ed מיד.</li>
</ol>6. איתור זיק"ב באמצעות תצוקת זיהומיות
<ol><li>ב BSC, להכין 24 לוחות תרבית רקמות היטב עם תאי Vero (105 תאים לבאר) 24 שעות לפני תחילת ההדבקה. סמן כל באר בזהות של יתוש / דגימה אחת.</li>
	<li>אם דגימות הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס, אפשר להפשיר.</li>
	<li>הסר את המדיה מלוחות התא Vero לפני החיסון עם דגימות צלחת אחת בכל פעם.</li>
	<li>עבור דגימות המכילות גופים או רגליים, בזהירות aliquot 100 μL של supernatant מובהר לתוך כל באר, דואג לא להפריע פסולת תא יתוש מן הכדור. הערה: דגימות רוק ניתן לדלל 1:1 (v/v) עם MCM לפני חיסון על תאים כדי לחסוך דגימות עבור titration מאוחר יותר, במידת הצורך.</li>
	<li>מעבירים את הלוחות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ודגרה למשך שעה.</li>
	<li>החזר את הצלחות ל- BSC והוסף ~ 1 מ"ל של כיסוי methylcellulose לכל באר. מניחים את הלוחות המכוסים בחזרה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי וירוס / זן).</li>
	<li>בצע קיבוע ופריטים חזותיים כמתואר בשלבים 3.6−3.9.</li>
	<li>לגבי ניקוד באמצעות מיקוד יצירת בדיקה, לכמת את הבארות החיוביות על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ אור. זיהוי של כתמים intracytoplasmic של תאים בבאר מצביע על נוכחות של וירוס. דגימות מקבלות ציון אך ורק כ-focus-חיובי או שלילי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence:+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us.">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867 (2019).</li><li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+vector+competence+studies:+A+review.">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li><li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus:+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li><li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission.">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li><li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses.">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li><li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses.">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li><li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus.">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).</li><li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes.">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).</li><li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence.">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+quinquefasciatus:+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus.">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 5 (9), 102 (2016).</li><li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite:+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process.">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 346 (2017).</li><li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li><li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses.">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li><li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus.">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li><li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts.">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li><li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission.">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li><li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+(L.)+from+Guerrero,+Mexico.">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li><li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+Gabon+(Central+Africa)+&#8211;+2007:+a+new+threat+from+Aedes+albopictus.">Zika virus in Gabon (Central Africa) &#8211; 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors.">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).</li><li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector.">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li><li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition.">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li><li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa.">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 462 (2019).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques.">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661 (2018).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus.">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li><li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice.">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072 (2019).</li><li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes,+Gulf+Coast,+United+States.">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li><li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות המתוארות כאן מספקות זרימת עבודה כללית לביצוע ניתוחי כשירות וקטורית. כמסגרת כללית, רבות מהמתודולוגיות הללו נשמרות ברחבי הספרות. עם זאת, יש מקום משמעותי לשינויים (נבדק אזר וויבר1). וירוס (למשל, שושלת ויראלית, אחסון של וירוס אתגר, היסטוריית מעבר ויראלית), אנטומולוגיה (למשל, ?...

יכולת וקטורית מוגדרת כיכולת ברמת המינים, האוכלוסייה ואפילו הפרט, של פרוקי רגליים נתון כגון יתוש, קרציה או זבוב חול פלבוטומין, לרכוש ולהעביר סוכן ביולוגית עם שכפול או התפתחות בפרוקי הרגליים1,2. ביחס ליתושים ווירוסים המועברים על ידי פרוקי רגליים (כלומר, ארבו-וירוסים), הסוכן מודבק ממארח וירמי על ידי יתושה נקבה. בעקבות בליעה, הנגיף חייב להדביק באופן פרודוקטיבי אחד מאוכלוסייה קטנה של תאי אפיתל midgut3, להתגבר על מכשולים פיזיולוגיים שונים כגון השפלה פרוטאוליטית על ידי אנזימי עיכול, נוכחות של המיקרוביוטה (מחסום זיהום midgut, או MIB), ואת מטריצה פריטרופית מופרשת. זיהום של אפיתל midgut חייב להיות מלווה שכפול של הנגיף ובסופו של דבר לברוח מן midgut לתוך מערכת הדם הפתוחה של היתוש, או המולימף, המייצג את תחילתו של זיהום מופץ להתגבר על מחסום הבריחה midgut (MEB). בשלב זה הנגיף יכול להקים זיהומים של רקמות משניות (למשל, עצבים, שרירים וגופי שומן) ולהמשיך לשכפל, אם כי שכפול משני כזה לא יכול להיות נחוץ בהחלט עבור הנגיף להדביק את תאי acinar של בלוטות הרוק (להתגבר על מחסום זיהום בלוטת הרוק). יציאה מתאי האצין של בלוטת הרוק לחללים האפיטליים שלהם ואז תנועה לתוך צינור הרוק מאפשרת חיסון של הנגיף למארחים הבאים על נשיכה, ומשלימה את מחזור השידור1,2,4,5,6,7.
בהתחשב במנגנון ההתפשטות המאופיין היטב והשמור בדרך כלל בתוך וקטור יתושים, הערכות כשירות וקטור מעבדה דומות לעתים קרובות באופן מתודולוגי, אם כי הבדלים בפרוטוקולים קיימים1,2. בדרך כלל, לאחר חשיפה לנגיף הפה, יתושים נותחים כך שרקמות בודדות כגון אמצע, רגליים, שחלות או בלוטות רוק יכולות להיבדק לזיהום ויראלי, זיהום מופץ, זיהום מופץ / שידור טרנסו-אווריאלי פוטנציאלי, וזיהום מופץ / יכולת שידור פוטנציאלית, בהתאמה8. עצם נוכחותו של וירוס בבלוטות הרוק, עם זאת, אינה עדות מוחלטת ליכולת ההדבקה, בהתחשב בראיות של מחסום בריחה /יציאה של בלוטת הרוק (SGEB) בכמה שילובים וקטור / וירוס1,2,4,5,7,9. השיטה הסטנדרטית להוכחת כשירות שידור נותרה העברת יתושים לחיה רגישה10,11,12. עם זאת, בהתחשב בכך עבור arboviruses רבים זה מחייב את השימוש של מודלים מורין immunocompromised13,14,15,16, שיטה זו היא לעתים קרובות עלות-אוסרת. חלופה נפוצה היא אוסף של רוק יתושים, אשר ניתן לנתח על ידי תגובת שרשרת שעתוק הפוך-פולימראז (RT-PCR) או בדיקה זיהומית כדי להדגים את נוכחותו של הגנום הנגיפי או חלקיקים זיהומיים, בהתאמה. ראוי לציין כי שיטות איסוף רוק במבחנה כאלה עשויות ערך יתר עלהמידה 12 או לזלזל17 את כמות הנגיף שהופקד במהלך האכלת vivo, המציין כי נתונים כאלה חייבים להתפרש בזהירות. עם זאת, שיטת מביטה היא בעלת ערך רב כאשר מנותחת מנקודת המבט של עצם נוכחות הנגיף ברוק, מה שמצביע על פוטנציאל ההדבקה.
קיימות שתי גישות עיקריות לקביעת תפקידם של וקטורים יתושים בהתפרצויות מחלות ארבו-ויראליות. השיטה הראשונה כוללת מעקב שדה, שבו יתושים נאספים בהקשר של שידור פעיל18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, בהתחשב בכך ששיעורי ההדבקה הם בדרך כלל נמוכים למדי (למשל, שיעור ההדבקה המשוער של 0.061% יתושים באזורים של וירוס זיקה פעיל (ZIKV) במחזור בארצות הברית21), הפללה של מינים וקטוריים פוטנציאליים יכולה להיות מוטה בכבדות על ידי לכידת מתודולוגיה25,26 וסיכוי אקראי (למשל, דגימת אדם נגוע אחד מתוך 1,600 לא נגוע)21 . אם ניקח זאת בחשבון, מחקר נתון לא יכול לרכוש יתושים מספיק הן במספרים גולמיים או מגוון מינים כדי לדגום במדויק יתושים המעורבים בהעברת. לעומת זאת, ניתוחי כשירות וקטורית מתבצעים במסגרת מעבדה, המאפשרים שליטה קפדנית בפרמטרים כגון מינון אוראלי. למרות שאינם מסוגלים לייצג את המורכבות האמיתית של זיהום יתושים ויכולת שידור במסגרת שדה, הערכות מעבדה אלה נשארות כלים רבי עוצמה בתחום הארבו-וירביולוגיה.
בהתבסס על ניתוחי כשירות וקטור שונים עם ZIKV במספר מינים של יתושים, אוכלוסיות ושיטות27,28,29,30,31,32, כמו גם סקירה אחרונה של הערכות יכולת וקטורית1, אנו מתארים כאן כמה מהפרוטוקולים הקשורים לזרימת עבודה וקטורית טיפוסית. בניסויים אלה, שלוש אוכלוסיות Ae. aegypti מאמריקה (העיר סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה התחתון, TX, ארה"ב) נחשפו לזן יחיד של ZIKV (Mex 1-7, גישה GenBank: KX247632.1) ב 4, 5, או 6יומן 10 יחידות יוצרות מיקוד (FFU)/ mL באמצעות מקת דם מלאכותי. לאחר מכן, הם נותחו לראיות לזיהום, זיהום מופץ ויכולת שידור לאחר זמנים שונים של דגירה קיצונית (2, 4, 7, 10 ו -14 ימים) באמצעות ניתוח ובסיס מדבקות מבוסס תרבות תאים. למרות שזרימת העבודה/הפרוטוקולים הנוכחיים ממוטבים עבור ZIKV, אלמנטים רבים ניתנים לתרגום ישיר לארובווירוסים אחרים המועברים על ידי יתושים ברמות בלימת פרוקי רגליים וביו-בטיחות 2 ו-3 (ACL/BSL2 או ACL/BSL3).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3mL Standard Reservoir</td>
			<td>R37P30</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#34; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td>
			<td>4RJH9</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Grinding Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A16-P4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>A6419-1G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Primary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td>
			<td>5450-0011</td>
			<td>KPL/Seracare</td>
			<td>Secondary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NC0427256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Decontamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td>
			<td>10-126-34</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>C0775-100G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td>
			<td>13-675-15B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-22</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FU1 Feeder</td>
			<td>FU1-0</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; feeding units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>140-040-182</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&#956;g/mL, 50mL/Bottle</td>
			<td>15-290-026</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td>
			<td>7203706</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>Bloodmeal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InsectaVac Aspirator</td>
			<td>2809B</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &#176;C), 250g/Bottle</td>
			<td>M0512-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td>
			<td>C849T34</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>M5904-5X5ML</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>OR37-25</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Plugs</td>
			<td>PP5-250</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS6 Power Unit (110-120V)</td>
			<td>PS6120</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td>
			<td>4525</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td>
			<td>50-809-242</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&#956;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td>
			<td>21-402-487</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-486</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-484</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-482</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>85300</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td>
			<td>5510-0030</td>
			<td>Seracare</td>
			<td>Developing solution for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

ההליכים שהוצגו מתארים מתודולוגיה כללית להדביק יתושים Aedes aegypti עם וירוס זיקה בתנאי מעבדה כדי לקבוע את קצב ההדבקה, זיהום מופץ, והעברה פוטנציאלית של הנגיף באוכלוסיית היתושים המדוברת. הליכים אלה נמצאים בשימוש נרחב עם שינויים שונים בהערכות כשירות וקטורית ברחבי העולם. הם חשובים בקביעת התפקיד הפוטנציאלי כי יתוש נתון (כלומר, מינים, אוכלוסייה, הפרט) עשוי לשחק בהעברת סוכן נתון.

שלוש אוכלוסיות של Ae. aegypti מאמריקה (סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה, TX, ארה"ב) נחשפו לזן התפרצות של ZIKV מאמריקה (ZIKV Mex 1-7, מדינת צ'יאפס, מקסיקו, 2015) על מגוון של טיטרים של דם (4, 5, ו -6 יומן10 FFU / mL) שהוצגו בקם דם מלאכותי מבוסס אריתרוציטים אנושי שטוף. בימים 2, 4, 7, 10 ו - 14 לאחר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K Views.  University of Texas Medical Branch. הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

Video: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

הצלה של וירוס רקומביננטי Zika מתוך כרומוזום מלאכותי בקטריאלי cDNA שיבוט

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...