우리는 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대한 세계 참조 센터의 직원을 인정 : 박사 로버트 테시, 힐다 구즈만, 박사 케네스 플랜테, 박사 제시카 플랜트, 디오나 샤튼, 그리고 디비야 미르 찬다니, 큐레이팅및 우리와 다른 그룹의 능력 실험에 사용되는 바이러스 균주의 많은 을 제공하는 그들의 지칠 줄 모르는 작업에 대한. 제시된 작품은 맥러플린 펠로우십 펀드(SRA)와 NIH 보조금 AI120942 및 AI121452에 의해 지원되었다.

이러한 프로토콜에서 수행된 모든 절차는 기관 생물 안전 위원회와 갤버스턴에 있는 텍사스 대학 의료 지점의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜을 완전히 준수하여 수행되었습니다.
1. 베로 셀에서 ZIKV 증폭
<ol><li>베로 세포(CCL-81 또는 VeroE6)는 덜벡코의 이글의 최소한의 필수 매체(DMEM)를 10% v/v 열불성 태아소 혈청(FBS)으로 보충하고, 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL 및 10g/mL)을 분해합니다. 각각) 가습37°C 인큐베이터에서 5%CO2에서 80-90% 사이를 150cm2 조직 배양 플라스크로 결합한다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛 (BSC)에서, 배지를 제거하고 10 % 표백제 또는 이중 사위 암모늄(재료의 표)의작업 희석 중 하나에서 폐기한다. 즉시 세포 당 0.1-1 전염성 바이러스 입자를 목표로, 바이러스 육수의 1 mL로 단층을 접종. 무접종이 단층 전체에 닿을 수 있도록 플라스크를 즉시 교반한다.</li>
	<li>2% v/v 열비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-연쇄 절제술을 보충한 DMEM을 사용하여 배지를 5mL의 부피로 위로 올려주세요. 그런 다음 플라스크를 가습된 37°C 인큐베이터로 이동하여 60분 동안 5% CO2를 입력합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 BSC로 가져옵니다. 2% v/v 열 비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-연쇄 절제술을 보충한 DMEM을 사용하여 총 15mL의 총 부피에 배지를 추가합니다. 플라스크를 가습된 37°C 인큐베이터로 5% CO2로이동한다.</li>
	<li>세포 병 증 효과의 증거에 대 한 위상 대비 현미경 검사에서 매일 플라스크를 검사 (CPE). 세포의 약 40-50%만이 단층층에 남아 있을 때 바이러스 수확(step 1.7)으로 진행하며, 일반적으로 3-5일 후감염후체가 활용되고 있는 것으로 나타났다.</li>
	<li>수퍼내를 흡인하고 50mL 원물 바이알에 배치합니다. 원심분리(3,500 x g 20분)로 셀룰러 파편의 상부를 명확히 한다. 참고: 여러 플라스크가 동일하게 감염된 경우 여러 플라스크의 슈퍼나티를 50mL 원추형 튜브로 결합할 수 있습니다.</li>
	<li>50mL 원뿔관에서 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 상체관을 새로운 튜브로 제거합니다. 열 비활성화 FBS를 30%(v/v)의 최종 농도로 보충합니다. Aliquot 개별 나사 캡 튜브에이 혼합물을 보고 사용 될 때까지 -80 °C에서 동결.</li>
</ol>2. 인공 혈액 식 준비
<ol><li>당일 모기는 전염성 혈류에 노출되어야 하며, 수유장치(재료표)가모기가 노출될 때까지 예열되는 것을 하는 절지동물 봉쇄 시설에서 전원(재료표)을 켜야 한다.</li>
	<li>아래에 설명된 방법 중 하나를 사용하여 인공 혈액식을 준비하십시오.<ol>
<li>방법 1: 신선하게 수확된(1주일 이내에) 상업적으로 구입한 1:1 v/v의 혈액을 바이러스 성 육수와 결합합니다(섹션 1에 설명된 대로 준비). 참고: 이 방법은 혈액에 존재하는 바이러스/바이러스 가족에 어떤 항체의 부재에 우발적입니다.</li>
		<li>항체의 부재를 확인할 수 없거나 혈액 공급원이 이전에 flavivirus 노출을 갖는 것으로 알려져 있는 경우, 세척 및 수동으로 적혈구를 포장.<ol>
<li>BSC에서, 50 mL 원판 관에 전체 인간의 혈액의 30 mL을 추가하고 인산완충식식염수 (PBS)와 최대 50 mL를 얹습니다.</li>
			<li>원심 분리기 3,500 x g에서 20 분 동안.</li>
			<li>10% 표백제를 함유한 트레이 팬에 부드럽게 붓거나 이중 사위 암모늄을 희석하여 적혈구 펠릿을 버리지 않도록 주의하여 초퍼를 흡습하십시오.</li>
			<li>PBS의 10 mL을 추가하고 부드럽게 적혈구 펠릿이 재구성 된 있도록 BSC의 바닥에 원적 튜브의 바닥을 누릅니다. PBS로 서스펜션의 볼륨을 최대 50mL까지 가져옵니다. 부드러운 반전으로 섞으세요.</li>
			<li>2.2.2.1−2.2.2.2.4 총 4-6x를 반복합니다. 상체가 명확하거나 약간 분홍색이며 더 이상 불투명하지 않은지 확인합니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여 모든 상체를 제거합니다. PBS의 1-2 mL에서 적혈구 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
			<li>혈중 밀 조립: 포장 된 적혈구 350 μL, 100 μL 100 μL 10% 자당, 200 μL 의 열 비활성화 FBS, 900 μM 재조합 ATP, 2 mL의 DMEM을 사용하여 적절하게 희석 된 바이러스 재고 2 % v / v 열 비활성화 FBS, 1 % (v/v-펜)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염되지 않은마우스의피부와 표준 3mL 저수지 단위(재료 표)를 오버레이합니다(다른 옵션으로는 파라핀 필름, 콜라주공 막 또는 소시지 케이스포함).</li>
	<li>덮인 저수지를 흰 종이 타월에 놓습니다. 한 번에 1mL의 저수지에 전염성 혈밀의 ~2mL를 넣습니다. 누설의 증거를 피더 아래 수건을 검사합니다. 누출이 있는 경우 피더에서 피밀을 회수하고 덮개를 폐기하십시오. 플러그로 피더를 밀봉합니다. 누출이 없는지 다시 한번 확인합니다.</li>
</ol>3. 혈중식사/플라크 분석의 백티션
<ol><li>준비된 블러드밀의 남은 부피를 사용하여, DMEM을 사용하여 10배 직렬 희석 시리즈(즉, 희석된 10x에서 1,000,000x까지) DMEM을 사용하여 2% v/v 열비활성화 FBS, 1%(v/v) 페니실린-streptomycin을 수행한다.</li>
	<li>가장 희석된 에서 가장 농축된 24 또는 12개의 우물 판으로 희석의 Aliquot 100 μL.</li>
	<li>37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 1h의 인큐베이션을 위해 인큐베이션합니다.</li>
	<li>1 h 인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트를 BSC로 다시 가져와 서 메틸셀룰룰로오스 오버레이 1mL 또는 2mL를 24웰 또는 12개의 웰 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>오버레이 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣고 3-7일 동안 배양한다(바이러스 변형 에 의존).</li>
	<li>인큐베이션을 따라 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 BSC로 가져옵니다. 메틸셀룰로오스 오버레이를 10% 표백제 또는 이중 사분위 암모늄 소독제가 들어 있는 트레이 팬에 넣습니다.</li>
	<li>PBS로 2배 씩 잘 씻고, 10% 표백제 또는 이중 사분위 암모늄이 들어 있는 트레이 팬에 세척을 폐기합니다.</li>
	<li>메탄올:아세톤(1:1 v)의 ~1mL를 추가하고 실온(RT)에서 BSC에서 최소 30분 동안 세포가 플레이트에 고정되도록 합니다. 유기 폐기물에 대한 제도적 정책에 따라 메탄올 : 아세톤을 폐기하십시오.</li>
	<li>아래에 설명된 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 ZIKV를 시각화합니다.<ol>
<li>메탄올제거에 이어 5분 동안 크리스탈 바이올렛 액액(0.25%w/v/v/v30%)으로 즉시 얼룩을 제거하였다. 수돗물에 2x를 헹구고 건조하게 두근 다음 눈으로 직접 눈으로 시각화하여 플라크 또는 모노레이어파괴의 증거를 제시합니다.</li>
		<li>또는 초점 형성 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>유기 고정이 남아있을 때까지 접시가 건조하게 하십시오. 참고: 이것은 BSC 외부에서 ~ 2-3 h가 걸리지만 BSC 또는 화학 연기 후드에서 공기 건조로 가속 될 수 있습니다.</li>
			<li>비멸 성 PBS (Mg2 + 및 Ca 2+ 무료)에서 각 우물을 3x3x로 세척하십시오. PBS를 제거하고 각 웰에 블로킹 솔루션(PBS + 3% FBS)을 추가하고 RT에서 15분 동안 바위를 추가합니다.</li>
			<li>블로킹 용액에서 α-ZIKV 또는 α 플라비바이러스 1차 항체(예: 플라비바이러스 그룹 hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2])의 웰당 100 μL을 추가합니다. RT에서 최소 4 시간 (바람직하게는 하룻밤, 18 h를 초과하지 않음)에 대한 흔들로 배양하십시오.</li>
			<li>기본 항체를 제거하고 궤도 플레이트 로커에서 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 무료)로 각각 15분 동안 3배 세척합니다.</li>
			<li>차단 버퍼에 희석된 이차 항체(염소 α 마우스 HRP 라벨)의 우물당 100 μL을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 흔들로 인큐베이션하십시오.</li>
			<li>궤도 플레이트 로커에 PBS (Mg2 + 및 Ca 2+ 무료)와 함께 각각 15 분 동안 3 배 세척하십시오.</li>
			<li>염기판 개발 시약의 Aliquot 100 μL(재료의 표)잘 당. 15 분 동안 RT에서 바위 접시.</li>
			<li>기판을 제거하고 수돗물로 플레이트 2x를 헹구어 포시/플라크의 발달 시 반응을 중단합니다. 수돗물을 붓고 정량화하기 전에 접시가 건조하게 하십시오.</li>
			<li>주어진 샘플에 존재하는 FFU의 수를 결정하기 위해 바이러스 성 포시를 카운트.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 혈중식 관리
<ol><li>Ae. aegypti 모기 2-4 일 포스트 백과를 사용하십시오. 여성 모기를 0.5 L 골판지 판지 팩에 가려진 뚜껑으로 분류하고 설탕을 박탈하십시오 (일반적으로 36-48 h 전 전염성 혈밀). 수분 포화 면공을 통해 광고 리비툼 물을 제공합니다.</li>
	<li>모기가 전염성 혈중에 노출될 것이라는 아침에 수분포화 면공을 제거하십시오.</li>
	<li>투명한 플라스틱 장갑 상자 안에 인공 혈액식이 포함된 저장소를 먹이 장치에 부착합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 0.5L 골판지 상자에 50-100개의 굶주린 Ae. aegypti 모기가 들어 있는 스크리닝 된 뚜껑이 있는 0.5 L 골판지 상자를 저수지에 부착된 먹이 장치 아래에 놓습니다. 참고: 적절하게 굶주리고 있는 모기는 일반적으로 20분 이내에 먹이를 줄 것입니다. (ZIKV) 바이러스 성 티터가 ~60 분 후에 피더 내에서 감소 할 수 있기 때문에, 이 60 분 이상 연장해서는 안되지만, 느린 인구에서 샘플 크기를 증가시키기 위해 필요에 따라 수유를 연장 할 수 있습니다.</li>
	<li>수유가 완료되면 저수지를 제거하고 갓 만든 10% 표백제에 담급니다.</li>
	<li>-20°C에서 30초 또는 냉장고에서 5분 동안 인큐베이션으로 모기를 냉정한 마취시합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 모기를 얼음 위에 페트리 접시에 붓습니다. 계산하고 unengorged 모기에서 engorged 여성을 정렬합니다. 70%의 에탄올로 채워진 50mL 튜브 원내관에 침수하여 모기를 폐기하십시오. 모기는 여전히 마취되어 있는 동안, 0.5 L 골판지 판지 상자에 다시 붓고 화면과 뚜껑으로 빠르게 덮습니다. 초과 화면 메시를 판지에서 잘라테이프로 메시를 고정합니다.</li>
	<li>각 판지의 화면에 10% 수성 자당을 여과한 멸균으로 포화 된 면 공을 추가합니다. 모든 모기 상자를 습기를 유지하기 위해 젖은 스폰지가있는 대형 플라스틱 보조 용기에 놓습니다.</li>
	<li>모기 판기가 들어 있는 이차 용기는 27± 1°C의 온도(또는 관심 지역의 조건을 시뮬레이션하기 위해 적절하다)에 80%± 상대 습도 및 16:8 광:암사이클)을 넣습니다. 실험이 완료될 때까지 10%의 자당에 대한 광고 리비툼 액세스를 사용하여 모기를 유지하십시오.</li>
</ol>5. 샘플 수집 및 처리
<ol><li>지정된 일 후 먹이에, 장갑 상자 내에서 기계 적 흡인체를 사용하여 적절한 판지에서 모기의 소정의 수를 흡인. 필요한 수의 모기를 획득한 후 면둥근 면으로 수집 튜브를 캡합니다.</li>
	<li>-20°C에서 30초 간 또는 4°C에서 5분간 인큐베이션으로 모기를 마취합니다.</li>
	<li>글러브박스 안에는 모기를 얼음 위에 페트리 접시에 붓습니다. 두 쌍의 포셉을 사용하여, 각 모기의 다리 의 모든 6을 제거하고 살균 된 스테인레스 스틸 볼 베어링 (7/32") 및 500 μL의 모기 수집 매체 (MCM)를 포함하는 사전 표지 된 2 mL 둥근 바닥 미세 센심 분리 튜브에 배치, 2 % FBS, 1 % 페니실린 - streptocin, 2 μl</li>
	<li>모기를 미네랄 오일 한 방울에 부드럽게 놓고 제지하고, 오일과 모기의 머리와 프로보시스 사이의 접촉을 허용하지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>모기 프로보시스를 10 μL 파이펫 팁에 열 비활성화 FBS 10 μL로 채우십시오. 참고: 또는 파이펫을 자당, 혈액 또는 미네랄 오일로 채울 수 있습니다. 오일은 가벼운 현미경 을 통해 타액 기포의 직접 시각화를 허용합니다.</li>
	<li>모기가 30 분 동안 침을 뱉도록 하십시오. FBS +타액을 함유한 마이크로피펫 팁을 MCM의 100 μL을 포함하는 마이크로센심심분리기 튜브에 배출한 다음, 멸균된 강철 볼 베어링과 500 μL의 MCM을 포함하는 별도의 2mL 원형 하단 미세 센세리후이튜브에 시체를 배치합니다. 바디, 다리 및 타액에 사용되는 튜브가 동일한 모기에서 유래한 세 가지 샘플이 모두 명확하도록 라벨이 부착되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>모기가 침을 흘리는 동안 나머지 모기에 5.3-5.5 단계를 수행하십시오.</li>
	<li>몸과 다리를 포함하는 튜브를 BSC 내에 포함된 비드 밀링 조직 균질화 장치로 운반한다. 모든 신체 및 다리 샘플을 26Hz에서 5분 동안 세리게 하여 바이러스 성 입자를 상체로 방출합니다. 모든 샘플을 200 x g에서 200 x g로 5분 간 명확히 하여 셀룰러 이물질을 배출합니다. 참고: 이 시점에서 샘플은 -80°C에서 동결되거나 즉시 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 전염성 분석에 의한 ZIKV 검출
<ol><li>BSC에서, 감염성 분석의 개시 전에 베로 세포 (우물 당 105 세포) 24 시간으로 24 개의 잘 조직 배양 판을 준비합니다. 단일 모기/샘플의 ID로 각각 잘 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>샘플이 -80°C에서 동결된 경우 해동을 수 있습니다.</li>
	<li>샘플 한 플레이트를 한 번에 한 접시로 접종하기 전에 베로 셀 플레이트에서 미디어를 제거합니다.</li>
	<li>몸이나 다리를 포함하는 샘플의 경우, 각 우물에 정제 된 수퍼 나탄의 100 μL을 신중하게 알리쿼트하여 펠릿에서 모기 세포 파편을 방해하지 않도록주의하십시오. 참고: 타액 샘플은 필요한 경우 나중에 적정을 위해 샘플을 보존하기 위해 세포에 접종하기 전에 MCM으로 1:1 (v/v)을 희석할 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 이동하고 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트를 BSC에 반환하고 각 웰에 메틸셀룰룰로오스 오버레이의 ~1mL을 추가합니다. 오버레이 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 다시 넣고 3-7일 동안 배양합니다(바이러스/변형에 의존).</li>
	<li>3.6-3.9 단계에 설명된 대로 고정 및 시각화를 수행합니다.</li>
	<li>초점 형성 분석서를 통한 채점과 관련하여, 경현미경하에서 검사를 통해 양성 우물을 정량화한다. 우물에서 세포의 intracytoplasmic 염색의 검출은 바이러스의 존재를 나타냅니다. 샘플은 초점 양성 또는 -negative로만 채점됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

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여기에 설명된 메서드는 벡터 역량 분석을 수행하기 위한 일반화된 워크플로우를 제공합니다. 일반적인 틀로서, 이러한 방법론의 대부분은 문학 전체에 걸쳐 보존된다. 그러나 수정할 여지가 있습니다(아자르와 위버1에서검토됨). 바이러스(예를 들어, 바이러스 계보, 도전 바이러스의 저장, 바이러스 통로 역사), 곤충학(예를 들어, 모기 집단의 실험실 식민지화, 타고난 면역, 모?...

벡터 능력은 종, 인구, 심지어 개인의 수준으로 정의되며, 모기, 진드기 또는 플렙보토민 모래 와 같은 주어진 절지동물의 능력으로 정의되며, 절지동물1,2에서복제 또는 발달로 생물학적으로 에이전트를 획득 및 전송한다. 모기와 절지동물 매개 바이러스(즉, arboviruses)와 관련하여, 이 에이전트는 여성 모기에 의해 비레믹 숙주로부터 면역을 당합니다. 섭취 후, 바이러스는 중구 상피 세포3의작은 인구 중 하나를 생산적으로 감염시켜야하며, 소화 효소에 의한 프로테오분해분해, 미생물(midgut 감염 장벽 또는 MIB)의 존재, 및 분비된 수막 매트릭스와 같은 다양한 생리적 장애물을 극복해야 한다. 미드구트 상피의 감염은 바이러스의 복제와 모기의 개방 순환 시스템으로 미드구트에서 탈출, 또는 혈청 림프, 미드 구트 탈출 장벽을 극복 전파 감염의 발병을 나타냅니다 (MEB). 이 시점에서 바이러스는 이차 조직 (예를 들면, 신경, 근육 및 지방 바디)의 감염을 확립하고 복제를 계속할 수 있습니다, 비록 그 같은 이차 복제는 타액 땀샘의 아신 세포를 감염하기 위하여 바이러스를 위해 엄격하게 필요하지 않을 수 있더라도 (침샘 감염 장벽을 극복). 타액선 아시나르 세포로부터 의충구멍으로 의한 후 타액 덕트로 이동하면 바이러스를 물고 후속 호스트로 접종할 수 있게 하고, 전송 주기1,2,4,5,6,7을완료한다.
모기 벡터 내에서 확산되는 이러한 특성화되고 일반적으로 보존된 메커니즘을 감안할 때, 실험실 벡터 능력 평가는 프로토콜의 차이가1,2존재하지만종종 방법론적으로 유사합니다. 일반적으로, 경구 바이러스 노출 후, 모기는 중간구체, 다리, 난소, 또는 타액 선반과 같은 개별 조직이 바이러스 감염, 보급 감염, 보급 감염/잠재적 인 트랜스변변성 전염 및 전파 된 감염 /잠재적 인 전송 능력에 대해 분석 될 수 있도록 해부된다8. 타액선에 바이러스의 단순한 존재는, 그러나, 일부 벡터/바이러스조합1,2,4,5,7,9에서타액 선 탈출/송신 장벽(SGEB)의 증거를 감안할 때, 전송 능력의 확실한 증거가 아니다. 전송 능력을 증명하는 표준 방법은취약한동물(10,11,12)에모기 전송을 유지한다. 그러나, 많은 arboviruses에 대해 이 것들은 면역 손상된뮤린모델(13,14,15,16)의사용을 필요로 한다는 점을 감안할 때, 이 방법은 종종 비용 금지이다. 일반적으로 사용되는 대안은 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 또는 바이러스 게놈 또는 전염성 입자의 존재를 각각 입증하기 위해 전염되는 분석으로 분석될 수 있는 모기 타액의 수집이다. 이러한 체외 타액 수집 방법은 생체 내 수유 중에 증착된 바이러스의 양을12또는 과소 평가할 수 있으며, 이는 이러한 데이터를 주의해서 해석해야 한다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 체외 방법은 타액에서 바이러스의 단순한 존재의 관점에서 분석할 때 매우 유용하며, 이는 전염 가능성을 나타낸다.
arboviral 질병 발발에 있는 모기 벡터의 역할을 결정하기 위한 2개의 중요한 접근이 존재합니다. 첫 번째 방법은 모기가 활성 전송18,19,20,21,22,23,24의맥락에서 수집되는 현장감시를포함한다. 그러나, 감염률이 전형적으로 매우 낮다는 점을 감안할 때(예를 들어, 미국21에서활성 Zika 바이러스(ZIKV) 순환 영역에서 모기의 감염률 추정0.061% 추정), 잠재적 벡터 종의 유죄 는 1,600명 중 1개에서 감염된 개인을 트래핑 방법론 25,26 및 무작위 확률(예를 들어) 트래핑 방법으로 심하게 편향될 수 있다. . 이를 고려하여, 주어진 연구는 전송에 관여하는 모기를 정확하게 샘플링하기 위하여 원시 수 또는 종 다양성 둘 다에 있는 충분한 모기를 취득하지 않을 수 있습니다. 대조적으로, 벡터 능력 분석은 실험실 조정에서 착수되어 경구 복용량과 같은 매개 변수를 엄격하게 제어 할 수 있습니다. 현장 환경에서 모기 감염 및 전송 능력의 진정한 복잡성을 완전히 대표할 수는 없지만, 이러한 실험실 평가는 arbovirology 분야에서 강력한 도구로 남아 있습니다.
여러 모기 종, 인구 및방법(27,28, 29,30,31,32)에서ZIKV를 통한 다양한 벡터 역량 분석뿐만 아니라 벡터 능력 평가1의최근 검토를 기반으로, 일반적인 벡터 역량 워크플로우와 관련된 몇 가지 프로토콜을 여기에서 설명한다. 이러한 실험에서, 미주 (살바도르의 도시, 브라질; 도미니카 공화국; 그리고 낮은 리오 그란데 밸리, TX, 미국)에서 세 Ae. aegypti 인구는 ZIKV의 단일 변형에 노출되었다 (멕스 1-7, GenBank 가입: KX247632.1) 4, 5, 또는 6 로그10 초점 단위에 의해 인공 요법 이어서, 해부 및 세포 배양 기반 전염 분석등을 통해 다양한 시간 동안 외래 배양(2, 4, 7, 10 및 14일)을 거쳐 감염, 보급감염 및 전송 능력의 증거를 분석하였다. 현재 워크플로/프로토콜은 ZIKV에 최적화되어 있지만, 많은 원소는 절지동물 봉쇄 및 생물 안전 수준 2 및 3(ACL/BSL2 또는 ACL/BSL3)에서 다른 모기 매개 아르보바이러스와 직접 변형될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3mL Standard Reservoir</td>
			<td>R37P30</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7/32&#34; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td>
			<td>4RJH9</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Grinding Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A16-P4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>A6419-1G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Primary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td>
			<td>5450-0011</td>
			<td>KPL/Seracare</td>
			<td>Secondary Antibody for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NC0427256</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Decontamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td>
			<td>10-126-34</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-740</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td>
			<td>07-200-91</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>C0775-100G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td>
			<td>05-402-7</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td>
			<td>13-675-15B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-30</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td>
			<td>13-675-22</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td>
			<td>S11150</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FU1 Feeder</td>
			<td>FU1-0</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; feeding units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>140-040-182</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&#956;g/mL, 50mL/Bottle</td>
			<td>15-290-026</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td>
			<td>25-200-114</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td>
			<td>11-965-118</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td>
			<td>7203706</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>Bloodmeal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InsectaVac Aspirator</td>
			<td>2809B</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &#176;C), 250g/Bottle</td>
			<td>M0512-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td>
			<td>C849T34</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>M5904-5X5ML</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Immobilization of Mosquitos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>OR37-25</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Plugs</td>
			<td>PP5-250</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS6 Power Unit (110-120V)</td>
			<td>PS6120</td>
			<td>Hemotek Ltd</td>
			<td>Insectary Equipment; power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td>
			<td>4525</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>Insectary Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td>
			<td>50-809-242</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&#956;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td>
			<td>21-402-487</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-486</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-484</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&#956;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td>
			<td>21-402-482</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>Plastic consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>85300</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td>
			<td>5510-0030</td>
			<td>Seracare</td>
			<td>Developing solution for focus forming assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td>
			<td>CRL-1586</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

제시된 절차는 감염의 비율을 결정하기 위하여 실험실 조건의 밑에 Zika 바이러스를 가진 Aedes aegypti 모기를 감염, 보급한 감염 및 문제의 모기 집단에 있는 바이러스의 잠재적인 전송을 확인하기 위하여 일반화한 방법론을 기술합니다. 이러한 절차는 전 세계적으로 벡터 역량 평가에서 다양한 수정과 함께 널리 활용됩니다. 그(것)들은 주어진모기 (즉, 종, 인구, 개별)가 주어진 에이전트의 전송에서 재생할 수 있는 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요합니다.

Ae의 세 인구. 미주(살바도르, 브라질, 도미니카 공화국; 리오 그란데 밸리, TX, 미국)의 아이집트는 미주(ZIKV Mex 1-7, 치아파스 주, 멕시코, 2015)에서 혈액밀 티터(4, 5, 6 log10 FFU/mL)에서 인공 혈액 세척을 통해 ZIKV의 발병 균주에 노출되었다. 일 2, 4, 7, 10 및 14 소독에서, 모기의 하위 세트는 감염, 보급 및 잠재적 인 전송 속도를 결정하기 위해 처리되었다.
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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K 조회수.  University of Texas Medical Branch. 제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

연구

면역학 및 감염병학

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

세균성 인공 염색체 cDNA 클론에서 재조합 Zika 바이러스의 구조

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...