Name: vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Reconhecemos a equipe do Centro Mundial de Referência para Vírus Emergentes e Arboviroses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, por seu trabalho incansável na curadoria e fornecimento de muitas das cepas virais usadas para nossos e outros grupos experimentos de competência vetorial. O trabalho apresentado foi financiado pelas bolsas McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e nih grants AI120942 e AI121452.

Todos os procedimentos realizados nesses protocolos foram realizados em pleno cumprimento dos protocolos aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Filial Médica da Universidade do Texas em Galveston.
1. Amplie o ZIKV em células Vero
<ol><li>Cultivar células Vero (CCL-81 ou VeroE6) na modificação de Dulbecco do meio essencial mínimo (DMEM) da Eagle suplementado com 10% v/v de soro bovino fetal inativado (FBS) e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL e 100 μg/mL, respectivamente) em uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 a entre 80-90% de confluência em um frasco de cultura tecidual de 150 cm2.</li>
	<li>Em um armário de biossegurança (BSC), remova o meio e descarte em alvejante de 10% ou uma diluição de trabalho de amônio quaternário duplo(Tabela de Materiais). Inocular imediatamente a monocamada com 1 mL de estoque viral, visando 0,1-1 célula de partícula viral infecciosa. Agitar o frasco imediatamente de tal forma que o inóculo contate a monocamadas em sua totalidade.</li>
	<li>Cubra o médio a um volume de 5 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina de 1% (v/v) penicilina-estreptomicina. Em seguida, mova o frasco para a incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2 por 60 min.</li>
	<li>Remova o frasco da incubadora e leve-o para um BSC. Adicione meio adicional a um volume total de 15 mL usando DMEM suplementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v). Mova o frasco para uma incubadora umidificada de 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Examine o frasco diariamente sob microscopia de contraste de fase para obter evidências de efeitos citopáticos (CPE). Prossiga para a colheita viral (etapa 1.7) quando apenas aproximadamente 40-50% das células permanecem na monocamada, geralmente 3-5 dias após a infecção, dependendo da cepa de ZIKV sendo utilizada.</li>
	<li>Aspire o supernante e coloque em um frasco cônico de 50 mL. Esclareça o sobrenatante de detritos celulares por centrifugação (3.500 x g por 20 min). NOTA: Se vários frascos foram infectados de forma idêntica, supernacantes de vários frascos podem ser combinados em tubos cônicos de 50 mL.</li>
	<li>Remova o supernatante do tubo cônico de 50 mL para um novo, tomando cuidado para não interromper a pelota. Suplemente o supernatante com FBS inativado a calor a uma concentração final de 30% (v/v). Aliquotar esta mistura em tubos individuais de tampa de parafuso e congelar a -80 °C até usar.</li>
</ol>2. Preparação de farinhas de sangue artificiais
<ol><li>No dia em que os mosquitos devem ser expostos a farinhas infecciosas, ligue a fonte de energia (Tabela de Materiais) em uma instalação de contenção de artrópodes, de modo que as unidades de alimentação(Tabela de Materiais) estejam pré-aquecidos quando os mosquitos estiverem preparados para exposição.</li>
	<li>Prepare farinhas de sangue artificiais usando um dos métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Método 1: Combinar sangue humano recém-colhido (dentro de uma semana) citado ou heparinizado comprado comercialmente 1:1 v/v com estoque viral (preparado conforme descrito na seção 1). NOTA: Este método depende da ausência de quaisquer anticorpos para a família vírus/vírus estar presente no sangue.</li>
		<li>Se a ausência de anticorpos não puder ser confirmada ou a fonte de sangue for conhecida por ter exposição prévia ao flavivírus, lave e embale manualmente os eritrócitos.<ol>
<li>Em um BSC, adicione 30 mL de sangue humano inteiro a um tubo cônico de 50 mL e cubra até 50 mL com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifugar a 3.500 x g por 20 min.</li>
			<li>Aspire o supernatante, derramando suavemente em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou diluição de trabalho de amônio quaternário duplo, tomando cuidado para não descartar a pelota de eritrócito.</li>
			<li>Adicione 10 mL de PBS e bata suavemente a parte inferior do tubo cônico contra a parte inferior do BSC de tal forma que a pelota eritrócito tenha sido reconstituída. Leve o volume da suspensão até 50 mL com PBS. Misture por inversão suave.</li>
			<li>Repetição de passos 2.2.2.1−2.2.2.4 um total de 4-6x. Confirme se o supernatante é claro ou apenas ligeiramente rosa e não mais opaco. Remova todo o supernatante usando uma pipeta sorológica. Resuspend a pelota eritrócito em 1-2 mL de PBS.</li>
			<li>Monte a farinha de sangue: 350 μL de eritrócitos embalados, 100 μL de 10% de sacarose, 200 μL de FBS inativados pelo calor, ATP recombinante de 900 μM e 2 mL de estoque de vírus apropriadamente diluído usando DMEM complementado com FBS inativados por calor de 2% v/v e 1% (v/v) penicilina-estreptomicina.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobreponha uma unidade de reservatório padrão de 3 mL(Tabela de Materiais) com a pele de um rato não infectado (outras opções incluem filme de parafina, membranas colágenas ou invólucro de salsicha).</li>
	<li>Coloque o reservatório coberto em toalhas de papel branco. Adicione ~2 mL de farinha de sangue infecciosa ao reservatório 1 mL de cada vez. Inspecione a toalha debaixo do alimentador para obter qualquer evidência de vazamento. Se houver vazamentos, recupere a farinha de sangue dos alimentadores e descarte as tampas. Sele os alimentadores com plugues. Mais uma vez confirme que não há vazamentos.</li>
</ol>3. Backtitration of bloodmeals/plaque assay
<ol><li>Utilizando o volume restante da farinha de sangue preparada, realize uma série de diluição serial de 10x (ou seja, 6 diluições, variando de diluído 10x a 1.000.000x) utilizando DMEM complementado com FBS inativados por v/v de 2% v/v e penicilina-estreptomicina de 1% (v/v).</li>
	<li>Alíquota 100 μL das diluições nos poços de 24 ou 12 placas de poços das mais diluídas para as mais concentradas.</li>
	<li>Incubar por 1h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Ao final do período de incubação de 1 h, leve as placas de volta ao BSC e adicione 1 mL ou 2 mL de sobreposição de metilcelulose aos 24 poços ou 12 placas de poço, correspondentemente.</li>
	<li>Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (dependente de cepa do vírus).</li>
	<li>Após a incubação, remova as placas da incubadora e leve para o BSC. Descarte a sobreposição de metilcelulose em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou desinfetante de amônio quaternário duplo.</li>
	<li>Lave cada poço 2x com PBS, descartando a lavagem em uma panela de bandeja contendo 10% de alvejante ou amônio quaternário duplo.</li>
	<li>Adicione ~1 mL de metanol:acetona (1:1 v:v) e deixe as células fixarem na placa por pelo menos 30 minutos no BSC à temperatura ambiente (RT). Descarte metanol:acetona de acordo com a política institucional sobre resíduos orgânicos.</li>
	<li>Visualize o ZIKV usando um dos dois métodos descritos abaixo.<ol>
<li>Após a remoção do metanol:acetona, colora imediatamente com uma solução violeta cristalina (0,25% w/v em 30% de metanol) por 5 min. Enxágüe 2x na água da torneira e deixe secar, depois visualize diretamente de olho para evidências de placas ou destruição de monocamadas.</li>
		<li>Alternativamente, realize o ensaio de formação de foco.<ol>
<li>Deixe as placas secarem até que não haja restos orgânicos. NOTA: Este deve levar ~2−3 h fora do BSC, mas pode ser acelerado por secagem de ar em um BSC ou capô de fumaça química.</li>
			<li>Lave cada poço 3x por 15 min cada em PBS não ester (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital. Remova o PBS e adicione 1 mL de solução de bloqueio (PBS + 3% FBS) a cada poço e arrase por 15 min no RT.</li>
			<li>Adicione 100 μL por poço de α-ZIKV ou anticorpo primário α-flavivirus (por exemplo, híbridoma do grupo flavivírus D1-4G2-4-15 [4G2]) a uma solução de diluição de 1:2.000 na solução de bloqueio. Incubar com balanço por um mínimo de 4h (preferencialmente durante a noite, não excedendo 18 h) na RT.</li>
			<li>Remova o anticorpo primário e lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.</li>
			<li>Adicione 100 μL por poço do anticorpo secundário (cabra α mouse hrp-rotulado) diluído 1:2.000 no buffer de bloqueio. Incubar com balanço por 1h na RT.</li>
			<li>Lave 3x por 15 min cada com PBS (Mg2+ e Ca2+ livre) em um roqueiro de placa orbital.</li>
			<li>Alíquota 100 μL de reagente de desenvolvimento de substrato(Tabela de Materiais) por poço. Placas de rocha na RT por 15 minutos.</li>
			<li>Interrompa a reação após o desenvolvimento de focos/placas removendo o substrato e enxaguando as placas 2x com água da torneira. Despeje a água da torneira e deixe as placas secarem antes de quantificar.</li>
			<li>Conte focos virais para determinar o número de FFU presente na amostra dada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Administração de farinhas de sangue
<ol><li>Use mosquitos Ae. aegypti 2-4 dias após a eclosão. Classifique mosquitos fêmeas em caixas de papelão 0,5 L com tampas de tela e prive-os de açúcar (geralmente 36-48 h antes da farinha de sangue infecciosa). Forneça água ad libitum através de bolas de algodão saturadas de água.</li>
	<li>Remova as bolas de algodão saturadas de água na manhã em que os mosquitos serão expostos à farinha de sangue infecciosa.</li>
	<li>Anexar reservatórios contendo farinhas de sangue artificiais à unidade de alimentação leva dentro de uma caixa de luvas de plástico transparente.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, coloque uma caixa de papelão 0,5 L com tampa de tela, contendo 50-100 mosquitos Ae. aegypti famintos, sob a unidade de alimentação ligada ao reservatório. NOTA: Mosquitos apropriadamente famintos geralmente se alimentam dentro de 20 minutos. A alimentação pode ser prolongada conforme necessário para aumentar o tamanho da amostra em populações mais lentas, embora isso não deva se estender além de 60 minutos, porque o título viral (ZIKV) pode diminuir dentro do alimentador após ~60 min.</li>
	<li>Após a conclusão da alimentação, remova o reservatório e mergulhe em alvejante recém-feito 10%.</li>
	<li>Mosquitos anestesizem a frio por incubação para 30 s a -20 °C ou por 5 min em uma geladeira.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Conte e classifique as fêmeas engorgadas de mosquitos não engorgados. Descarte os mosquitos não engorgados por imersão em um tubo cônico de tubo de 50 mL cheio de 70% de etanol. Enquanto os mosquitos ainda estão anestesiados, despeje-os de volta na caixa de papelão 0,5 L e cubra rapidamente com a tela e a tampa. Corte a malha de tela em excesso da caixa e fixe a malha com fita.</li>
	<li>Adicione uma bola de algodão saturada com sacarose estéril filtrada 10% aquosa na tela de cada caixa. Coloque todas as caixas de mosquitos em um grande recipiente secundário de plástico com uma esponja úmida para manter a umidade.</li>
	<li>Coloque recipiente secundário contendo caixas de mosquitos em uma incubadora com temperatura de 27 ± 1 °C (ou conforme apropriado para simular condições na região de interesse) com 80% ± 10% de umidade relativa e um ciclo claro de 16:8:escuro). Mantenha os mosquitos com acesso a ad libitum a 10% de sacarose até a conclusão dos experimentos.</li>
</ol>5. Aquisição e processamento de amostras
<ol><li>Nos dias de pós-alimentação especificados, aspire um número predeterminado de mosquitos das caixas apropriadas usando um aspirador mecânico dentro de um porta-luvas. Tampe o tubo de coleta com uma rodada de algodão após a aquisição do número necessário de mosquitos.</li>
	<li>Mosquitos anesthetize frio por incubação por 30 segundos a -20 °C ou por 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Dentro do porta-luvas, despeje os mosquitos em uma placa de Petri no gelo. Usando dois pares de fórceps, remova todas as seis pernas de cada mosquito e coloque em um tubo de microcentrifusidade de fundo redondo de 2 mL pré-rotulado contendo um rolamento de esfera de aço inoxidável esterilizado (7/32") e 500 μL de mídia de coleta de mosquitos (MCM) composta de DMEM, 2% FBS, 1% penicilina-estreptomicina e 2,5 μg/mL de anfotericina.</li>
	<li>Coloque suavemente o mosquito em uma gota de óleo mineral para contê-lo, tomando cuidado para não permitir qualquer contato entre o óleo e a cabeça do mosquito e proboscis.</li>
	<li>Insira o proboscis do mosquito em uma ponta de pipeta de 10 μL preenchida com 10 μL de FBS inativados pelo calor. NOTA: Alternativamente, a pipeta pode ser preenchida com sacarose, sangue ou óleo mineral. O óleo permite visualização direta de bolhas de saliva através de microscopia leve.</li>
	<li>Deixe o mosquito salivar por 30 minutos. Ejete a ponta de micropipette contendo FBS + saliva em um tubo de microcentrifuuge contendo 100 μL de MCM, em seguida, coloque a carcaça em um tubo de microcentrifuuge fundo redondo separado de 2 mL contendo um rolamento de esfera de aço esterilizado e 500 μL de MCM. Certifique-se de que os tubos utilizados para os corpos, pernas e saliva sejam rotulados para que fique claro que todas as três amostras se originaram do mesmo mosquito.</li>
	<li>Enquanto os mosquitos estão salivando, realize etapas 5.3-5.5 nos mosquitos restantes.</li>
	<li>Transporte os tubos contendo os corpos e pernas para um dispositivo de homogeneização de tecido de moagem de contas contido dentro de um BSC. Triturar todas as amostras de corpo e perna a 26 Hz por 5 minutos para liberar partículas virais para o supernante. Esclareça todas as amostras por centrifugação a 200 x g por 5 min para pelotas de detritos celulares. NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a -80 °C, ou avaliadas imediatamente.</li>
</ol>6. Detecção de ZIKV por ensaio infeccioso
<ol><li>Em um BSC, prepare 24 placas de cultura de tecido bem com células Vero (105 células por poço) 24 h antes do início do ensaio infeccioso. Rotule cada poço com a identidade de um único mosquito/amostra.</li>
	<li>Se as amostras foram congeladas a -80 °C, deixe descongelar.</li>
	<li>Remova a mídia das placas celulares Vero antes da inoculação com amostras de uma placa de cada vez.</li>
	<li>Para amostras contendo corpos ou pernas, alíquota cuidadosamente de 100 μL de supernanato clarificado em cada poço, tomando cuidado para não perturbar os detritos celulares do mosquito da pelota. NOTA: As amostras de saliva podem ser diluídas 1:1 (v/v) com MCM antes da inoculação nas células para conservar amostras para titulação posterior, se necessário.</li>
	<li>Mova as placas para uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 1h.</li>
	<li>Devolva as placas ao BSC e adicione ~1 mL de sobreposição de metilcelulose a cada poço. Coloque as placas sobrepostas de volta em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 e incubar por 3-7 dias (vírus/dependente de cepas).</li>
	<li>Realize fixação e visualização conforme descrito nas etapas 3.6-3.9.</li>
	<li>Quanto à pontuação através de um ensaio de formação de foco, quantifique os poços positivos por exame sob um microscópio leve. A detecção de coloração intracytoplasmática das células em um poço indica a presença de vírus. As amostras são pontuadas apenas como focus-positive ou -negativo.</li>
</ol>

<ol>
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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. 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X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os métodos aqui descritos fornecem um fluxo de trabalho generalizado para a realização de análises de competência vetorial. Como estrutura geral, muitas dessas metodologias são conservadas ao longo da literatura. No entanto, há espaço substancial para modificações (revisadas em Azar e Weaver1). Vírus (por exemplo, linhagem viral, armazenamento de vírus de desafio, histórico de passagem viral), entomologia (por exemplo, colonização laboratorial de populações de mosquitos, imunidade...

A competência vetorial é definida como a capacidade no nível de espécies, população e até mesmo um indivíduo, de um determinado artrópode, como um mosquito, carrapato ou mosca de areia de flebotomina, para adquirir e transmitir um agente biologicamente com replicação ou desenvolvimento no artrópode1,2. Com relação a mosquitos e vírus transmitidos por artrópodes (ou seja, arboviroses), o agente é absorvido de um hospedeiro virêmico por uma fêmea de mosquito. Após a ingestão, o vírus deve infectar produtivamente uma pequena população de células epiteliais midgut3, superando vários obstáculos fisiológicos, como a degradação proteolítica por enzimas digestivas, a presença da microbiota (barreira de infecção midgut, ou MIB), e a matriz peritrofídica secretada. A infecção do epitélio midgut deve ser seguida pela replicação do vírus e eventual fuga do midgut para o sistema circulatório aberto do mosquito, ou hemoglifo, o que representa o aparecimento de uma infecção disseminada superando a barreira de escape midgut (MEB). Neste ponto, o vírus pode estabelecer infecções de tecidos secundários (por exemplo, nervos, músculos e corpos de gordura) e continuar a se replicar, embora essa replicação secundária possa não ser estritamente necessária para que o vírus infecte as células acinares das glândulas salivares (superando a barreira da infecção da glândula salivar). O lagross das células acinares da glândula salivar em suas cavidades apical e, em seguida, o movimento no ducto salivar permite a inoculação do vírus em hospedeiros subsequentes na mordida, e completa o ciclo de transmissão1,2,4,5,6,7.
Dado esse mecanismo bem caracterizado e geralmente conservado de disseminação dentro de um vetor de mosquitos, as avaliações de competência vetorial laboratorial são muitas vezes metodologicamente semelhantes, embora existam diferenças nos protocolos1,2. Geralmente, após a exposição ao vírus oral, os mosquitos são dissecados para que tecidos individuais como o midgut, pernas, ovários ou glândulas salivares possam ser testados para infecção viral, infecção disseminada, infecção disseminada/transmissão transovarial potencial e competência de transmissão disseminada/potencial,respectivamente 8. A mera presença de um vírus nas glândulas salivares, no entanto, não é evidência definitiva da capacidade de transmissão, dada a evidência de uma barreira de fuga/saída da glândula salivar (SGEB) em algumas combinações vetoriais/vírus1,2,4,5,7,9. O método padrão para comprovar a competência de transmissão continua sendo a transmissão do mosquito para um animal suscetível10,11,12. No entanto, dado que para muitas arboviroses isso requer o uso de modelos murinas imunocomprometidos13,14,15,16, este método muitas vezes é proibitivo. Uma alternativa comumente utilizada é a coleta da saliva do mosquito, que pode ser analisada por reação de cadeia transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) ou um ensaio infeccioso para demonstrar a presença do genoma viral ou partículas infecciosas, respectivamente. Vale ressaltar que tais métodos de coleta de saliva in vitro podem superestimar12 ou subestimar17 a quantidade de vírus depositado durante a alimentação in vivo, indicando que tais dados devem ser interpretados com cautela. No entanto, o método in vitro é altamente valioso quando analisado na perspectiva da mera presença de vírus na saliva, indicando potencial de transmissão.
Existem duas abordagens importantes para determinar o papel dos vetores de mosquitos em surtos de doenças arbovirais. O primeiro método envolve a vigilância em campo, na qual os mosquitos são coletados no contexto de transmissão ativa18,19,20,21,22,23,24. No entanto, dado que as taxas de infecção são tipicamente bastante baixas (por exemplo, a taxa estimada de infecção de 0,061% de mosquitos em áreas de circulação ativa do vírus Zika (ZIKV) nos Estados Unidos21), a incriminação de espécies vetoriais potenciais pode ser fortemente tendenciosa pela metodologia de captura25,26 e chance aleatória (por exemplo, amostragem de um indivíduo infectado de 1.600 não infectados)2 . Levando isso em conta, um determinado estudo pode não adquirir mosquitos suficientes tanto em números brutos quanto na diversidade de espécies para amostrar com precisão os mosquitos envolvidos na transmissão. Em contrapartida, as análises de competência vetorial são realizadas em ambiente laboratorial, permitindo um controle rigoroso de parâmetros como a dose oral. Embora não sejam totalmente capazes de representar a verdadeira complexidade da infecção por mosquitos e da capacidade de transmissão em um ambiente de campo, essas avaliações laboratoriais permanecem ferramentas poderosas no campo da arbovirologia.
Com base em diversas análises de competência vetorial com ZIKV em diversas espécies de mosquitos, populações e métodos27,28,29,30,31,32, bem como uma revisão recente das avaliações de competência vetorial1,descrevemos aqui vários dos protocolos associados a um típico fluxo de trabalho de competência vetorial. Nestes experimentos, três Ae. populações de aegypti das Américas (cidade de Salvador, Brasil; República Dominicana; e do baixo Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostas a uma única cepa de ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 ou 6 log10 unidades de formação focal (FFU)/mL por meio de doses de sangue artificial. Posteriormente, foram analisadas evidências de infecção, infecção disseminada e competência de transmissão após vários momentos de incubação extrínseca (2, 4, 7, 10 e 14 dias) por meio de dissecção e ensaio infeccioso baseado em cultura celular. Embora o fluxo de trabalho/protocolos atual seja otimizado para ZIKV, muitos elementos são diretamente traduzíveis para outras arboviroses transmitidas por mosquitos nos níveis de contenção de artrópodes e biossegurança 2 e 3 (ACL/BSL2 ou ACL/BSL3).

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Os procedimentos apresentados descrevem uma metodologia generalizada para infectar mosquitos Aedes aegypti com zika vírus em condições laboratoriais para determinar a taxa de infecção, infecção disseminada e potencial transmissão do vírus na população do mosquito em questão. Esses procedimentos são amplamente utilizados com várias modificações nas avaliações de competência vetorial globalmente. São importantes na determinação do papel potencial que um determinado mosquito (ou seja, espécie, população, indivíduo) pode desempenhar na transmissão de um determinado agente.

Três populações de Ae. aegypti das Américas (Salvador, Brasil; República Dominicana; e o Vale do Rio Grande, TX, EUA) foram expostos a um surto de ZIKV das Américas (ZIKV Mex 1-7, Estado de Chiapas, México, 2015) sobre uma gama de de farinha de sangue (4, 5 e 6 log10 FFU/mL) apresentados em um eritrócito humano lavado. Nos dias 2, 4, 7, 10 e 14 pós-infecção, subconjuntos de mosquitos foram processados para determinar as taxas de infecção, disseminação e potencial de transmissão.
<p...

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

Análises de competência vetorial sobre mosquitos Aedes aegypti que usam zika vírus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

vector-competence-analyses-on-aedes-aegypti-mosquitoes-using-zika

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K visualizações.  University of Texas Medical Branch. O protocolo apresentado pode determinar a competência vetorial das populações do mosquito Aedes aegypti para um determinado vírus, como o Zika, em um ambiente de contenção.

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Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genética

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Imunologia e Infecção

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantificação de realce dependente de anticorpo do vírus nas células humanas primárias Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biologia

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Isolamento de vírus associados a mosquitos coletados em campo

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...