このプロトコルは、ネッタイシマカの適応度を反映した標準的な測定を示しており、これらの適応度パラメータは、繁殖の成功を反映し、測定が容易で、文献で一般的に報告されているために選択されました。まず、卵の紙を滅菌水に一晩置いて、トランスジェニック蚊と野生型の蚊を孵化させます。幼虫が自由に餌をやれるようにするには、魚のすりつらを数滴垂らします。
成体が処女であることを確認するには、蛹が出てきたら性別で蛹を分離し、蛹をガラス顕微鏡スライドに移し、ティッシュで余分な水分を取り除いて蛹を固定します。2倍から4倍の倍率のステレオスコープの下で、先端の細かい絵筆を使用して、蛹を上向きに配置します。次に、尾を視覚的に分析して、生殖器葉の形状の違いを確認します。
オスとメスの蛹を別々のウォーターカップに入れ、適切に封じ込めます。野生型またはトランスジェニック遺伝子駆動1匹または遺伝子駆動2匹の雄を処女野生型の雌と大量に交配するには、麻酔をかけた蚊を雄5匹対雌1匹の割合で、約150匹の蚊を含む蚊のカートンに加えます。2〜3日後、ケージに血液源を提供して、標準的な飼育方法に従ってメスに栄養を与えます。
血液を与えられた女性と栄養を与えられていない女性を選別するには、腹部の充血を視覚的にスクリーニングし、部分的に栄養を与えていない女性、栄養を与えた女性、および男性を捨てます。充血したメスをそれぞれのケージに戻します。2〜3日後、鉛筆で事前にラベル付けされた濾紙で裏打ちされた50ミリリットルの円錐形チューブに個々の女性を入れます。
すべてのチューブに5ミリリットルの水道水を入れます。レーズンまたは砂糖に浸したコットンボールの小片を各円錐形のチューブに置きます。女性を1〜2日間インセクターに放置し、産卵させます。
次に、各紙の卵の数を数え、各紙で数えた卵の数をスクリーニングした女性の数で割った平均繁殖力を計算します。卵紙を乾燥させるには、チューブから水を排出し、それらをインセクターに戻します。完了した繁殖力研究から血液を与えられた雌を凍結するには、蚊のケージを摂氏マイナス20度に約15分間置きます。
各蚊の左翼を解剖し、翼と胸部の関節を切除し、翼全体を取り除きます。鉗子を使用して、翼をスライドガラスの上に平らに置き、次に70%エタノールを含む15ミリリットルのストック溶液を1滴と食器用洗剤1滴をトランスファーピペットを使用してスライド上の翼に加えます。次に、カバースリップに80%グリセロールを1滴加え、エタノール石鹸液の翼の上に置きます。
スライドに取り付けられた翼を65mmレンズのカメラで撮影します。TpsDigソフトウェアを使用して、ランドマークの2次元デカルト座標を特定します。原稿に記載されているRスクリプトを使用して、翼の長さと面積を計算します。
翼の中心点から各ランドマークの平方距離の合計の平方根として定義される形状から統計的に独立したサイズの尺度である翼重心サイズを計算します ハッチ 個々のF1卵 単一の女性から集めた紙から、100ミリリットルの新鮮な滅菌脱イオン水を含むポリプロピレンの透明なデリ容器。孵化後2〜3日で、卵紙を水から取り出し、一晩乾燥させます。卵紙を最初に孵化したのと同じ容器で再孵化させます。
最初の孵化後3〜5日で、幼虫を目視検査してトランスジェニックマーカーを探します。陽性または陰性のトランスジェニック幼虫の数を記録します。陰性の幼虫を捨てます。
トランスジェニック幼虫または対照幼虫の数を卵の総数で割ったものとして受精能を計算します。性比を決定するには、個々の成虫の雌の蚊ごとに、研究のタイムライン全体で収集された雌の数または雄の数を追加します。この数を、1人の女性によって生成された同じ蚊の系統で収集された蛹の数で割ります。
幼虫の生存率を判断するには、成虫の雌の蚊ごとに研究タイムライン全体で収集された蛹の総数を追加します。この数を、以前にカウントしたのと同じラインの個々の成虫の雌の蚊ごとにカウントされた幼虫の数で割ります。孵化後、幼虫から蛹への発育までの平均時間として計算します。
オスの寄与度を決定するには、トランスジェニックまたはコントロールオス50匹とコントロールメス100匹を64オンスのカートンに交配し、オス50匹とメス100匹になるようにします。交尾後、標準的な飼育方法に従って、蚊に血の食事を提供します。次に、完全に充血した個々の女性を、事前にラベル付けされた白い濾紙で裏打ちされた50ミリリットルの円錐形チューブに分けます。
女性をインセクターに1〜2日間放置し、産卵させます。紙をインセクターのチューブで少なくとも5日間乾燥させます。鉗子を使用して紙を取り外し、ハッチングのために置きます。
孵化後2〜3日で、卵紙を水から取り出し、乾かします。同じ容器で卵紙を再孵化します。最初の孵化後3〜5日で、幼虫を目視検査してトランスジェニックマーカーを探します。
オスの寄与を、F2トランスジェニック幼虫の数を蚊の系統あたりの総幼虫の数で割ったものとして計算します。50匹のオスと50匹のメスの野生型またはトランスジェニック年齢が一致した非血液供給蚊を適切な囲いに移します。毎日死んだオスとメスの蚊の数を追跡します。
蚊がケージ内で死ぬまでの平均経過日数として寿命を計算し、情報に基づかない原因で死んだ蚊を除外します。幼虫から成蛹まで、および蛹から成体までの発育時間を、Kruskal-Wallis'ANOVAとDunnの事後比較で評価しました。野生型のオスの蚊は野生型のメスよりも蛹化までの時間が短かったが、D7L1 oneのオスはD7L1のメスと比較して蛹化時間に有意差がなかった。
D7L1の雌は、野生型の雌よりも蛹化に達するのに時間がかかり、D7L1の雄も野生型の雄と比較していました。蛹から成体までの発育時間については、野生型とD7L1の雌は有意差がなく、野生型の雄は野生型の雌とD7L1の雄よりも早く蛹化する。野生型の雌の蚊は、研究中に生存時間の中央値に達することはありませんでした。
他のすべてのグループは、生存期間の中央値に明確な時間的分離を伴って、40日前に生存期間の中央値に到達しました。D7L1ノックアウト蚊は、野生型の蚊よりも翼面積が有意に小さかったが、翅や重心の大きさに違いはなかった。ナノスまたはZPGプロモーターの発現下で遺伝子ドライブカセットの1つのコピーを保有する蚊は、幼虫の生存率という顕著な例外を除いて、ヒッグスワイドアイラインと比較して有意な適応度を示しませんでした。
ここで収集されたフィットネスデータは、数学的モデリングなどのダウンストリームアプリケーションで使用できます。新しい遺伝的制御戦略を評価する研究では、ここで概説した小規模なスキルフィットネス研究の後に、セミフィールド条件での大規模なケージ研究が必要になります。ラボでのフィットネス研究は、遺伝子ノックアウトまたはノックインの意図しない影響を特定するのに役立ちます。
唾液タンパク質をノックアウトすると、発生ストレスが誘発される可能性があるが、遺伝子ドライブ1と2の蚊の遺伝子ドライブは幼虫の生存率が低いことを示した。遺伝子ドライブの適応度を測定することは、数学的モデリング後の集団シミュレーションにおけるその持続性に強く影響しました。
