このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の緑膿菌に対するウイルスおよびファージカクテルの調製および投与を容易にする。この技術の主な利点は、細菌感染を打ち消すにファージの有効性のインビボ評価を可能にすることです。ファージカクテルは、野生型と嚢胞性線維症ゼブラフィッシュモデルの両方で効率的です。
嚢胞性線維症患者における細菌感染にファージ療法を適用する可能性を開く。ファージ療法は、他のモデルシステムにおける特定の細菌感染を打ち消すためにも適用することができる。実験用のファージストックを準備する。
0.05 P.aeruginosa培養のOD 600に7番に1.25倍の10を加えて、負の3に10倍の感染を起こし、OD 600が0.1〜0.3に低下するまで揺れで3〜4時間培養します。インキュベーションの終わりに、37°Cで30分間、DNAseおよびRNAAseの1ミリリットルあたり1マイクログラムでリゼートをインキュベートする。遠心分離により細胞をペレット化する。
遠心分離の終わりに0.8マイクロメートルの細孔径を通して上清をフィルターし、PEG 6000のリットル当たり58グラムの塩化ナトリウムと105グラムを加えます。一晩摂氏4度で溶液をインキュベートします。翌朝、遠心分離によってファージを沈殿する。
遠心分離の終わりに上清を取り除き、慎重にトリスナトリウム塩化ナトリウムバッファーの15ミリリットルにファージペレットを溶解します。セシウム塩化物密度勾配によってファージを精製するには、まずSW 41ローター用ポリアロマー超遠心チューブに4つの異なる塩化セシウム溶液の2ミリリットルを層化し、各チューブにファージ懸濁液の3.5ミリリットルを加える。塩化セシウムは有毒です。
この化合物を取り扱い、廃棄する際には、必ず適切な安全手順を採用してください。すべてのチューブが積み込まれたら、チューブがバランスの取れた状態でローターにチューブを入れ、バランスを取ります。そして、100、000倍gと摂氏4度で2時間サンプルを遠心分離します。
遠心分離の終わりに、19ゲージ針の注射器を使用して、Dの間の白い層を吸引し、Dは1.4密度領域に等しい。そして新しいSW 60サイズのポリアロマー管に懸濁液を移す。150、000倍g、摂氏4度で少なくとも16時間の懸濁液を遠心分離する。
そして、6,000ダルトンカットオフで透析管に目に見えるバンドを転送します。その後、採取したサンプルを透析1回20分間、トリスナトリウム塩化水素に対して一晩で500ミリリットルの水に対して2回透析する。翌朝、0.22マイクロメートルの細孔フィルターで得られたファージストックをフィルタリングし、4°Cでストックを保存します。
マイクロ注入の日に、滅菌水中の2つのミクロモルモルフォリノストック溶液を胚当たり0.25ピコモラーの最終濃度に希釈し、5マイクロリットルモルフォリノ注射溶液を得る。そして各溶液に0.5マイクロリットルのフェノールレッドを加える。次に、20マイクロリットルのマイクロピペットを用いて、微細なゲルローディングチップを使用して、モルフォリノ混合溶液の全容を持つマイクロ注射針をロードし、ステレオ顕微鏡の下でスタンドに接続されたマイクロマニピュレータに針を固定します。
次に、1つまたは2つの細胞で、シマウマの魚の胚を直径96ミリメートルのペトリ皿内に配置されたガラススライドに配置し、マイクロ注射針先端でコリオンと黄身を貫通し、モルフリノ混合物の2ナノリットルを胚に注入する。受精後26時間で、約5マイクロリットルのP.緑膿吸砂を用いてマイクロ注射針をロードし、ダクトが黄身嚢の上に広がり始めるCuvierのダクトの出発点に針を背もてに挿入する。PAO1接種物の1〜3ナノリットルを胚に注入し、体積がダクト内で直接膨張し、循環に入ることを確認します。
注射後、胚を28°Cで30分または3時間のインキュベーションでフェニルチウリアを補充した新鮮なE3培地を含む2つの新しいペトリ皿のうちの1つに移す。次に、マイクロ注射針に約5マイクロリットルのファージカクテルをロードし、マイクロインジェクタに針を固定します。その後、以前に細菌を注入した各胚のCuvierのダクトにファージカクテルの1〜3ナノリットルを注入し、28°Cでフェニルチオ尿を添加した新鮮なE3培地を含む2つの新しいペトリ皿の1つに胚を入れる。
感染後4時間で、プラスチックピペットを使用して麻酔下胚をガラス底皿に移します。そして、暖かい低融点アガロース溶液で料理を満たします。アガロースが冷たくなったら、麻酔液を加えたE3培地で軽く満たします。
皿をステレオ顕微鏡の下に置き、ピペットチップを使用して胚を所望の方向に配置します。次に、GFP陽性菌用蛍光フィルターを使用して、感染後最大18時間の蛍光ステレオ顕微鏡の下に皿を置き、感染後9時間、14時間、18時間でGFP発現の進行のための胚を画像化します。感染後8時間で細菌の負担を判断するには、15個の麻酔注射された胚を1.5ミリリットル遠心分離管に移し、麻酔液をPBSで1%Triton X-100の300マイクロリットルに置き換えます。
胚を均質化するために、インスリン注射器の滅菌27ゲージ針を少なくとも15回通過する。そして、得られた混合物の100マイクロリットルを希釈1回あたり900マイクロリットルの無菌PBSに移すことによってホモジネートの連続希釈を調製する。自然アンピシリン耐性P.aeruginosa株のために選択するには、アンピシリンを補充LB寒天に希釈料10マイクロリットルをプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。
翌日はコロニーの数を数えます。コロニー形成単位の総数と感染した胚あたりのコロニー形成単位の平均数の計算を可能にする。P.aeruginosa感染の致死性を評価するために、死んだ白色の不透明な胚の数を数えることによって、ステレオ顕微鏡の下で感染後20時間で注入された胚をスコアする。
次に、感染後20時間で注入された胚の50%が死亡したP.aeruginosaの半分の最大致死濃度50用量を計算する。嚢胞性線維症を検証するために、心臓肝および膵臓などの内臓の障害のある位置を表現型が評価できる。細菌の負担は、P.Aeruginosaに感染した嚢胞性線維症胚におけるファージ療法によって軽減される。
GFP陽性P.アエロギノーザ菌に感染した受精後48時間で、胚投与ごとに30コロニー形成単位が感染後20時間で50%致死性を示す。ファージ療法は、細菌注射の30分または7時間後に送達された場合、感染後20時間で同様に有効である。ここでは、感染後4、9、14、18時間で胚を注入した嚢胞性線維症およびGFP陽性P.Aeruginosaが示されている。
対照的に、嚢胞性線維症プラスP.Aeruginosaプラスファージ注入胚は、細菌に対するファージ作用による蛍光低下を示す。嚢胞性線維症胚におけるP.aeruginosa感染によって生成された炎症反応は、シブラフィッシュを注射した対照と比較して、P.aeruginosa注射に続くP.aeruginosa注射に続く炎症性サイトカイン、TNFアルファおよびインターロイキン1ベータの発現によって明らかにされるように有意に増加する。しかし、両方の炎症性サイトカインの発現は、ファージカクテル共注射動物において減少する。
ファージは、調製中に保持され得る汚染された内毒素を除去するために慎重に精製されなければならない。ファージ製剤は、電子顕微鏡法で、ビリオン形態を評価して分析することができる。ヒト患者の緑膿菌以外の細菌による感染が、嚢胞性線維症ゼブラフィッシュモデルにおけるファージ療法で治癒できるかどうかをテストすることは興味深いだろう。
