こんにちは、私の名前はグルプレットです。私たちの研究室では、肺の炎症と修復のメカニズムを調査しています。こんにちは、私の名前はジェシカと私は蛍光顕微鏡法を使用してオゾン誘発ラボラットアルベオリを調査します。
こんにちは皆さん、私の名前はマンプリートです。そして、私は動物のイメージング方法で肺の炎症を研究します。肺は、オゾンなどの無菌、細菌性リポ多糖類またはLPSなどの微生物成分に起因する直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。
圧倒的な宿主応答は、無秩序な宿主免疫、凝固性、組織改修により、肺好中球の募集によって特徴づけられる呼吸障害および急性肺損傷をもたらす可能性がある。我々は、様々なコンパートメント、すなわち気管支肺胞洗浄液、すなわちBAL、肺血管パーズート、すなわちLVP、左肺クライオ切片、末梢血および胸骨および大腿骨骨髄の包括的な分析を記述する。オゾン暴露の場合、マウスをカスタム誘導ボックスにそっと入れ、マウスを0.05 PPMのオゾンに2時間連続的に曝します。
LPS曝露の場合、軽い腹腔内ケタミンとキシラジンミックスの下でマウスを麻酔する。LPS溶液から50マイクロリットルをマウスの外部ナレスに植え付けるようになりました。50マイクロリットルの滅菌生理食塩水を含むマウスを植え付ける。
指定された時点で、ケタミンとキシラジンミックスの全用量でマウスを麻酔する。次に、マウスを消毒し、後肢の数字のいずれかをつまむペダル反射をチェックし、四肢の引き込みを観察します。反射なしは深い麻酔を意味しない。
今、胸骨の下にカットを行い、心臓を露出します。ヘパリン化された注射器に取り付けられた25本のゲージ針を右心室に入れ、心臓穿刺で血液を引き出す。ヘパリン化された注射器で血液を収集し、さらなる処理のためにマイクロフュージチューブに排水します。
ピンセットまたは鈍い鉗子を慎重に使用して、上の組織から気管領域を取り除きます。今、肺を露出させるために肋骨ケージをカットします。気管の下に綿の合字を渡し、当分の間はそのままにしておきます。
気管を切り取り、気管切開のために肺からその長さの約3分の1の間隔で配置する。気管に28ゲージのポリエチレンカニューレを挿入します。綿の合字をしっかりと結び、カニューレを所定の位置に保持します。
カニューレを折りたたまないで下ろしてください。今徐々に1 mL注射器の助けを借りてカニューレにPBSの0.5 mlを注入します。吸引に抵抗しない限り、PBS吸引注射器を注入した後。
標識されたマイクロファージチューブに吸気液を採取し、この手順をさらに2回繰り返します。肺灌流中のバックアップを避けるために、胸部と腹部の半分の間の位置で下降胸部大動脈を切断します。切り取られた大オルタの端の近くの空洞を血を流さないで。
次に、肺に0.5MLの室温ヘパリン化生理満腹を浸透させ、右心室から注入する。下降胸部大動脈の切り取り端部の空洞から血管透過液を収集する。右気管支を結紮した後、左肺を0.5MLのパラホルムアルデヒドで5分間膨らませます。
今腹部部分を消毒します。腹部部分を切り、骨盤の骨から机を下さい。骨盤の骨を収集し、氷の上に保たれた生理食音で大腿骨と右大腿骨の骨を分離します。
腹側リブケージと胸骨を生理食動物で満たされたペトリ皿に集め、氷の上にも保管します。1 MLシリンジに十分にフィットした針を使用して、生理音の0.5 MLで骨のカット端を4回浸透させる。各骨の分数をラベル付きファルコンチューブに集め、フィルターを取り付け、氷の上に置きます。
遠心分離機は3000 RPMで10分間すべてのサンプルを。上清を収集し、フラッシュはそれらを凍結します。最低200マイクロリットルのPBSで細胞を再構成する。
白血球の総カウントを実行します。カルセイングリーンと赤エチジウムホモジマー1染色の混合物でBALの別の液体を染色する。ケモカインと総タンパク質濃度の上清を分析します。
細胞を遠心分離し、各スライドに2つのサイトスピンを調製し、生化学的および免疫タンパク質に対する染色を行います。すべてのグループの肺の凍結切片に修正されたHおよびE染色を行う。マージしたイメージパネルで、150 ~ 200 個のセルのアウトラインを手動で作成します。
すべてのチャンネルに、アウトライン化された領域をコピーします。すべてのチャンネルのプリセットパラメータを測定します。染色された分子の蛍光強度をDAPIまたはCD61の蛍光強度で割ります。
これらは、DAPIまたはCD61正規化蛍光強度比と呼ばれる。次に、パラメータをプロットして、露光後の変更を評価します。結合された暴露はBAL、LVPまたは胸骨骨髄細胞の総数に何の変化も誘発しなかったが、マウスは全身白血球増加症を24時間表示し、その後、暴露後72時間で白血球減少症が続いた。
これらは末梢血細胞数に表示されます。大腿骨骨髄細胞数は、すべての時間ポイントと比較した場合、72時間で遅いスパイクを示しています。BAL細胞スピンの画像では、24時間で多形核細胞にSiglec-F染色とCX3CRI染色がないことにご注意ください。
BALおよびLVP細胞スピンは、ゼロ時間で大きなCD11bおよびGR1陽性単核細胞の存在を示した。多形核細胞は、曝露後全ての区画において優勢な細胞型として提示される。BAL総タンパク質含量は、併用暴露後36時間で最も高かった。
しかし、LVPタンパク質は曝露後に変化はなかった。エオタキシン-2およびインターロイキン-2のレベルは、LVPの4時間で最も高かった。これらのケモカインはBAL画分で減少した。
興味深いことに、好中球の驚くべきIL-16および多くの先天的なケモカインはLVPで改変されたが、BALの分率は変化しなかった。ベースラインでは、BAL細胞の95%以上が皮質アクチン、ラメリポディア、ストレスおよびチューブリン繊維を示す単核であり、ミトトラッカー染色の減少に対して強く陽性であった。4時間で、アクチンを失った円形BAL細胞を観察したが、赤と低い減少したミトトラッカー染色に示すように微小管ネットワークが広がっていることを示した。
結合された暴露の早い段階で、BAL細胞はカルセインとエチジウムホモジマー-1に対して二重陽性に見え、これは部分的に損なわれた細胞を示す。36時間で、BAL細胞は主に緑色で生存可能であった。BAL肺胞マクロファージおよび好中球における離散ATPアルファおよびLy6G染色を観察した。
DAPI正規化ATP αの減少と細胞内Ly6Gタンパク質の含有量の増加を観察した。この結合された曝露は、バル、ナチュラルキラー細胞およびK1.1、好中球ATP、サブユニットPETA、増殖因子、Ki-67および好中球GR1、血小板CX3CRIおよび抗血管新生アンジオスタチンタンパク質の持続的な表現を曝露後のBAL細胞において誘導した。気管支および歯槽中隔損傷が予想されたが、曝露後36時間で大血管の細胞凝集を観察することは驚くべきことであった。
最後に、この表にサマライザの結果があります。私たちのマウスモデルは、侵襲的な細胞死と感染症のメカニズムを研究するためのレベル2の封じ込めラボで再現できる容易にアクセス可能なプロトタイプとして機能することを願っています。ありがとうございました。
