このプロトコルは、存在する微生物物質と環境アレルゲンがアレルギー性炎症の発症を調節する方法に関する非常に重要で未解決の問題に対処するように設計されました。具体的には、ここで提示される方法は、ハウスダニの二本鎖RNA種が生体内で免疫原性であり、好酸球性肺の炎症を調節できるかどうかを答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、シンプルで効率的で再現性が高く、一般的に使用されるツールや機器を使用して実行できることです。
これらの方法は、呼吸器ウイルス感染によって引き起こされる肺疾患を評価するためにも使用することができる。私の研究室の大学院生である李さんは、この手順をデモンストレーションするのに役立ちます。まず、アレルゲン、昆虫、および非昆虫アレルゲンから総RNAを単離することから始めます。
適正量の試料を1.4ミリメートルのセラミックビーズを含む2ミリリットルチューブに移し、液体窒素容器内で約10分間凍結します。各チューブにグアニジニウム・チオシアネートベースのRNA分離試薬を1ミリリットル加えます。その後、高エネルギー細胞破壊器を持つ昆虫と非昆虫の小動物を最高速度で45秒間壊します。
氷の上でサンプルを冷やし、このプロセスを2回繰り返します。新しい1.5ミリリットルチューブに溶液を移します。各チューブに200マイクロリットルのクロロホルムを加え、サンプルを渦に入れ。
チューブを摂氏4度で14分間14,000倍に遠心します。その後、上水相をイソプロパノール500マイクロリットルを含む新しいチューブに移します。サンプルを混ぜます。
その後、摂氏4度で14分間14,000倍gで遠心分離します。上清を慎重に吸引する。その後、75%エタノールの500マイクロリットルでRNAペレットを洗浄し、それを7、500倍のgで摂氏4度で10分間洗浄します。
慎重にすべての液体を取り除きます。ペレットを空気乾燥し、RNAを20~50マイクロリットルのRNaseフリー水で溶解する。RNA全体の二本鎖RNA構造を検出するには、200ナノグラム/マイクロリットルのRNAサンプルの2マイクロリットルを正に帯電したナイロン膜にスポットします。
UV架橋器で1,200マイクロジュールで1,200マイクロジュールで試料を膜に架橋する。スポッティングと架橋をさらに2回繰り返すと、ブロットあたり合計1.2マイクログラムのRNAが得られます。室温で振りながら、TBS-Tで5%ミルクで非特異的結合を1時間ブロックします。
次いでブロッキング溶液を除去し、抗二重鎖RNA J2抗体をTBS-Tの1%乳に1対1、000希釈で添加します。摂氏4度で揺れで一晩膜をインキュベートします。翌日、TBS-Tで洗浄1回5分間、膜を3回洗浄します。
二次抗体を加え、室温で1時間膜をインキュベートする。その後、TBS-Tでの使用を繰り返します。基材を加え、所望のシグナルが見えるまで5~15分間膜をインキュベートします。
二重蒸留水で膜をすすいで反応を止める。肺サンプルを採取するには、肺を組織紙に置き、各肺葉の小片を1個分切除する。ビーズを含む2ミリリットルのチューブに各部分を入れる。
気管支肺胞洗浄を収集するには、安楽死させたマウスを70%エタノールで消毒し、腹部の上部領域から首まで皮膚を切断するためにはさみを使用します。唾液腺とステルノイド筋肉を鉗子でそっと引き離し、気管を露出させます。その後、その下にナイロン弦を置きます。
カニューレを挿入するのに十分な喉頭の下の気管の切開を約2ミリリットルにし、気管とカニューレの周りに糸を結びます。カニューレの端に注射器を取り付け、新鮮なPBS-EDTAでロードします。その後、溶液の1ミリリットルを肺に注入し、吸引する。
カニューレから注射器を取り外し、溶液を15ミリリットルのチューブに排出します。新鮮なPBS-EDTAで氷を入れ、洗浄物をプールするために、このプロセスを繰り返します。チューブを摂氏4度で7分間500倍gで遠心分離する。
次に、ボリュームを記録し、ペレットを邪魔することなく上清を2つの1.5ミリリットルチューブに移します。ペレットを再懸濁した後、150マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、プレートを500倍gと摂氏4度で7分間遠心します。その後、ティッシュペーパーのプレートを素早く反転させて上清を除去します。
2.4G2ブロッキング抗体の存在下でFACSバッファー内の抗体を用いた細胞を染色し、暗い状態で30分間室温でプレートをインキュベートする。染色後、プレートを遠心分離し、500倍gの細胞を摂氏4度で7分間ペレットする。ティッシュペーパーのプレートを反転して染色液を取り除きます。
100マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、遠心分離を繰り返します。サンプルを150マイクロリットルのFACSバッファで再中断し、さらに350マイクロリットルのバッファを含むFACSチューブに移します。各サンプルに25マイクロリットルの計数ビーズを加え、フローサイトメトリー分析を進めます。
ハウスダニ、昆虫、および非昆虫小動物における長い二本鎖RNA構造の存在を、二本鎖のRNA特異的マウスモノクローナル抗体を用いてドットブロットで調べた。RNase IIIは、二本鎖RNAを12〜15個の塩基対断片に消化するために使用され、これはJ2では検出できなかった。マウス肺における自然免疫応答を刺激するハウスダニ総RNAの能力は、RT-qPCRによって実証された。RNase III治療は、ハウスダニ総RNAの免疫刺激活性を廃止し、二本鎖RNA構造が肺の自然免疫活性に不可欠であることを示した。
重症型2種類の肺炎症の発生に対するハウスダニ総RNAの阻害効果をFACS分析で評価した。好酸球性の肺炎症は、RNase IIIの有無にかかわらず治療されたダニ抽出物のダストによって誘発された。長い二本鎖RNA種の分解は、気管支肺胞洗浄および肺における好酸球数の増加に反映された重度の2つの肺炎症をもたらした。
特に、ダニ総RNA処理群における好酸球の数は、長い二本鎖RNA種を内因的に含んでいた元のダニ抽出物で処理された群と同等である。このプロトコルを試みるとき、この段階での肺への損傷が最終的な結果を変える可能性があるため、BAL流体を注入して回収する際には非常に注意してください。この手順に加えて、ELISAのような他の方法は、BAL液中に存在する非細胞可溶性内容物を分析するために行うことができる。
その開発後、この技術は、アレルギー性肺炎症の発症を調節できる非二重鎖RNA因子など、環境アレルゲンに存在する他の微生物物質を研究者が探索する道を開いた。
