虚血性損傷は、移植細胞の生存に影響を与える敵対的な炎症の環境を誘発する。我々のプロトコルは傷害に対する最初の免疫応答を回避することによって生物学的製剤を提供するための代替方法を提示する。このプロトコルの主な利点は、1週間後の治療を治療を投与することを可能にし、臨床環境における治療を模倣する。
私たちの主な焦点は、虚血再灌流傷害モデルとSTEM細胞の移植です。しかし、このアプローチは、生物学的療法の導入を伴う炎症性疾患のモデルにも利用することができる。すべての手術器具をオートクレーブから始めます。
1回のセッションで複数の手術を行う場合は、各動物の後に器具を清掃し、ホットビーズ滅菌器を使用して再殺菌します。皮下に鎮痛薬を投与し、動物を秤量し、その重量を人工呼吸器に入力する。胸骨から肩のレベルまで胸の左側を剃り、余分な毛皮を取り除くために脱毛クリームを塗ります。
肺崩壊を防ぐために、虚血再灌流手順のために2センチメートルの水で正の終わりの流れ圧力を維持し、細胞の遅延注入手順のために水の3センチメートルにそれを変更する。マウスを麻酔した後、20ゲージ気管チューブで挿管し、制御された加熱パッドに移して35〜37°Cの体温を維持します。マウスを左右の両端に置き、頭蓋の端を左側に、尾端を右側に置きます。
ポビトンヨウ素とアルコール綿棒の間で交互に手術領域を3回スクラブし、両眼に眼科軟膏を適用する。10本の刃メスを使用して、視野内の一番左の乳首の右側に2.5ミリメートルの垂直切開を行い、肋間筋と肋骨が見えるまではさみを使用して表面筋層を切断します。肋骨と周囲の組織を持ち上げながら、4番目と5番目の肋骨の間の肋間空間を切り取り、まぶたリトラクタをオープンスペースに挿入します。
湾曲した鉗子を使用して心膜を引き込み、肺を上方に動かします。9-0ナイロン縫合糸をLAD動脈の下の心筋2.5ミリメートル遠位から左大口に通し、組織の引き裂きや主要な血管の穿刺を防ぐために滑らかで一貫した動きを維持する。緩い正方形の結び目を結び、緩い結び目の中にポリエチレンチューブの1センチメートルを置きます。
チューブの周りの縫合糸を固定し、pallorと心室性不整脈によって虚血を確認し、35分後に放出する。チューブを取り外した後、5分間待って心筋の再灌流を確認します。24ゲージのIVカテーテルチューブを開口部の右側にある1つの肋間空間の胸腔に入れる。
6-0吸収性縫合糸を使用して、単純な中断パターンで肋間切開を閉じ、筋肉層を連続的な縫合パターンで閉じます。表面筋層を閉じた後、胸管を1ミリリットルの結核シリンで胸腔から取り出しながら取り出します。連続的な水平マットレスパターンの6-0の吸収性の縫合糸で皮の切開を閉じる。
終了したら、1.5ミリリットルの温かい生理食塩水を皮下に投与し、感染を防ぐために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。マウスを寝具のフリーケージまたは暖かいパッドの上に覆われた寝具とケージに移し、完全に回復するまで35〜37°Cの温度を取ります。前述のようにマウスを準備して挿管した後、はさみと鉗子で皮膚層から縫合糸を取り除き、その後、10番メスを使用して前の手術と同じ場所で切開を行います。
筋肉層の縫合が見えるまで瘢痕組織を切断し続け、その後、はさみと鉗子を使用して縫合糸を取り除き、筋肉層を切り開きます。肋骨を一緒に保持する縫合糸を取り除き、前の切開から肋間筋を切断し続けます。眼瞼レトラクタを肋間空間に配置し、前の結紮の領域を配置します。
300,000間葉系STEM細胞をPBSの20マイクロリットルに懸濁して30ゲージのインスリン注射器にロードし、注射のための適切な角度を達成するために針をわずかに曲げます。頂点から心臓の基部に向かって方向に移動し、針の開口部が心筋の内側に完全に入るまで梗塞部に注射器を挿入し、その後、ゆっくりと心筋に細胞を注入し、3秒間待ってから針を取り除きます。心室細動などの細胞に異常な反応がないことを確認するために、心臓を3分間注意深く観察します。
3分後、24ゲージのIVカテーテルチューブを開口部の右側にある1つの肋間空間の胸腔に入れます。肋間筋と皮膚層を閉じ、先に説明したように胸管を取り除きます。1.5ミリリットルの温かい生理食塩水を皮下に投与し、感染を予防するために切開部位にトリプル抗生物質軟膏を塗布する。
完全に回復するまで、ウォームパッドに覆われた寝具で寝具の無料ケージまたはケージにマウスを移します。術後の心エコー図と心電図は、STEM細胞移植を進める日に行われ、梗塞を確認し、心室収縮機能を低下させた。さらにデータを調べると、虚血性損傷を受けたマウスでは駆出率と分数短縮が減少し、拡張期末および収縮期の体積が増加した。
外傷後7日間の心筋組織のマッソン三色染色は、虚血性損傷を受けたマウスの心臓における左心室壁のコラーゲン沈着および薄化の増加を示した。生体内生物発光イメージングまたはBLIは、間葉系STEM細胞移植の翌日に行った。MCの正常な送達は、虚血再灌流損傷を誘発したがMSCを受け取らなかったマウスと比較してBLIシグナルによって例示される。
このプロトコルを試みる際には、肋間を切断し、血管を結紮し、細胞を注入する際の小さな意図的な動きは、視野内の心臓や肺への過度の損傷を防ぐために不可欠であることを覚えておいてください。これらの手順は、超音波、生物発光イメージングを介して細胞生存率、または使用される治療に応じてさらに分子または生化学的技術を介して移植後の心機能を監視する能力を提供する。
