Ишемическое повреждение вызывает враждебную провоспалительные условия, влияющие на выживание пересаженных клеток. Наш протокол представляет собой альтернативный метод обеспечения биопрепаратов, минуя первоначальный иммунный ответ на травмы. Основным преимуществом этого протокола является то, что он позволяет проводить терапии через неделю после травмы, имитируя лечение в клинических условиях.
Основное внимание мы делаем на модели ишемии реперфузии и трансплантации стволовых клеток. Однако этот подход также может быть использован для моделей воспалительных заболеваний, которые включают в себя введение биологической терапии. Начните с автоклавирования всех хирургических инструментов.
Если несколько операций должны быть выполнены в один сеанс, очистить инструменты после каждого животного и повторно стерилизовать их с помощью горячего стерилизатора бисера. Подкожно вводят обезболивающее, взвешивают животное и вводят вес в аппарат искусственной вентиляции легких. Бритье левой стороны грудной клетки от грудины до уровня плеча и нанесите крем для удаления лишнего меха.
Для предотвращения коллапса легких, поддерживать положительное давление конца истекающий на два сантиметра воды для процедуры ишемии reperfusion и изменить его на три сантиметра воды для задержки инъекции клеток процедуры. После анестезии мыши, intubate его с 20 калибровочных эндотрахеальной трубки и передать его на контролируемую грелку для поддержания температуры тела от 35 до 37 градусов по Цельсию. Поместите мышь в боковой лежачий с черепным концом слева и хвостовой конец справа.
Скраб хирургической области чередующихся между povidone йода и алкоголя тампоны три раза и применять офтальмологические мази для обоих глаз. Используйте скальпель лезвия номер 10, чтобы сделать вертикальный разрез 2,5 миллиметра справа от левого соска в поле зрения, а затем использовать ножницы, чтобы прорезать поверхностные слои мышц до тех пор, пока межреберные мышцы и ребра видны. При подъеме ребер и окружающих тканей, прорезать межреберного пространства между четвертым и пятым ребрами, а затем вставить втягиватель век в открытое пространство.
Убирайте перикард с помощью изогнутых типсов, перемещая легкие вверх и из вида. Пройдите 9-0 нейлонового шва через миокард под артерией LAD 2,5 миллиметра дистал к левой асикуле поддержания гладкого и последовательного движения, чтобы предотвратить разрыв ткани или прокол основных кровеносных сосудов. Свяжите свободный квадратный узел, затем поместите один сантиметр полиэтиленовых труб в свободный узел.
Закрепните шов вокруг труб и подтвердите ишемию бледной и желудочковой аритмией, а затем отпустите через 35 минут. После удаления трубки, ждать в течение пяти минут, чтобы подтвердить повторное перфузии миокарда. Поместите 24 калибра IV катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия.
Используйте 6-0 абсорбируемых швов, чтобы закрыть межреберный разрез в простой прерванный узор и мышечный слой в непрерывном узоре шва. После закрытия поверхностного мышечного слоя, удалить грудную трубку при снятии воздуха из грудной полости с одним миллилитровым шприцем туберкулина. Закройте разрез кожи 6-0 абсорбируемым швом в непрерывном горизонтальном рисунке матраса.
После завершения, ввещать 1,5 миллилитров теплого солевого подкожно и применять тройную мазь антибиотика к месту разреза для предотвращения инфекции. Перенесите мышь в клетку для постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями на теплой площадке и температурой от 35 до 37 градусов по Цельсию, пока она не будет полностью восстановлена. После подготовки и интубации мыши, как описано ранее, удалить шов из слоя кожи с ножницами и типсами, а затем использовать номер 10 скальпель, чтобы сделать разрез в том же месте, как предыдущая операция.
Продолжайте прорезать рубцовую ткань, пока мышечный слой шва видна, а затем использовать ножницы и миппы, чтобы удалить шов и сократить мышечный слой открытым. Снимите швы, держа ребра вместе и продолжайте прорезать межреберную мышцу от предыдущего разреза. Поместите втягиватель век в межреберное пространство и найдите область предыдущей перевязки.
Загрузите 300 000 мезенхимальных стволовых клеток, подвешенных в 20 микролитров PBS, в 30 калибровочный инсулиновый шприц и слегка согните иглу, чтобы достичь правильного угла для инъекций. Двигаясь в направлении от вершины к основанию сердца, вставьте шприц в пери-инфарктную область до тех пор, пока отверстие иглы полностью внутри миокарда, затем медленно ввилите клетки в миокард, подождите три секунды и удалите иглу. Внимательно наблюдайте за сердцем в течение трех минут, чтобы убедиться, что нет ненормальной реакции на клетки, такие как фибрилляция желудочков.
Через три минуты поместите 24 калибра IV катетер трубки в грудной полости одного межреберного пространства справа от отверстия. Закройте межреберные мышечные и кожные слои и удалите грудную трубку, как описано ранее. Администрирование 1,5 миллилитров теплого солевого подкожно и применять тройную мазь антибиотика к месту разреза для предотвращения инфекции.
Перенесите мышь в клетку для постельных принадлежностей или клетку с крытыми постельными принадлежностями на теплой площадке, пока она не будет полностью восстановлена. Послеоперационная эхокардиограмма и электрокардиограмма проводились в день продолжения имплантации стволовых клеток, подтверждая инфаркт и снижение желудочковой контрактильной функции. Дальнейшее изучение данных показало, что фракция выброса и дробное сокращение были уменьшены у мышей, получивших ишемическую травму, в то время как конечные диастолические и систолические объемы увеличились.
Массон трихромное окрашивание миокарда ткани семь дней после травмы показали увеличение осаждения коллагена и истончение стенки левого желудочка в сердцах мышей, которые получили ишемическую травму. В vivo биолюминесцентные изображения или BLI была выполнена на следующий день после мезенхимальной имплантации стволовых клеток. Успешная доставка MSCs иллюстрируется сигналом BLI по сравнению с мышами, которые индуцированных травмы ишемии реперфузии, но не получили MSCs.
При попытке этого протокола, имейте в виду, что небольшие преднамеренные движения при резке через межреберные, лигатирование сосуда, и инъекционные клетки имеют жизненно важное значение для предотвращения неправомерного повреждения сердца или легких в поле зрения. Эти процедуры дают возможность контролировать сердечную функцию после трансплантации с помощью ультразвука, жизнеспособность клеток с помощью биолюминесценции изображения, или дальнейшие молекулярные или биохимические методы в зависимости от используемой терапии.
