허혈성 손상은 이식 된 세포의 생존에 영향을 미치는 적대적인 염증 환경을 유도합니다. 우리의 프로토콜은 부상에 대한 초기 면역 반응을 우회하여 생물학적 제제를 제공하기위한 대체 방법을 제시합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 임상 환경에서 치료를 모방, 부상 후 1 주일 치료를 투여 할 수 있다는 것입니다.
우리의 주요 초점은 허혈 재관전 손상 모델과 STEM 세포의 이식에 있습니다. 그러나, 이 접근은 또한 생물학 치료의 소개를 관련시키는 선동적인 질병의 모형을 위해 이용될 수 있습니다. 모든 수술 기구를 자동화하여 시작합니다.
한 세션에서 여러 번의 수술을 수행하려면 각 동물 후 악기를 청소하고 뜨거운 비드 멸균기를 사용하여 다시 멸균하십시오. 피하 진통제를 투여하고, 동물의 무게를 측정하고, 인공호흡기에 무게를 입력합니다. 흉골에서 어깨 의 수준으로 가슴의 왼쪽을 면도하고 여분의 모피를 제거하기 위해 탈모 크림을 적용합니다.
폐 붕괴를 방지하기 위해, 허혈 재관전 시술을 위해 2센티미터의 물에서 양극성 기만 압력을 유지하고 세포 시술의 지연된 주입을 위해 3센티미터의 물로 변경한다. 마우스를 마취한 후 20게이지 내막 튜브로 삽관하여 제어된 가열 패드로 이송하여 섭씨 35~37도의 체온을 유지합니다. 마우스를 왼쪽에 두개골 끝이 있고 오른쪽에 는 caudal 끝이 있는 측면 회비에 놓습니다.
포비도요오드와 알코올 면봉을 세 번 번 교대로 수술 영역을 문질러 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. 10번 블레이드 메스를 사용하여 시야에서 왼쪽 젖꼭지의 오른쪽에 수직 절개 2.5밀리미터를 한 다음 가위를 사용하여 늑간 근육과 갈비뼈가 보일 때까지 피상 근육 층을 절단합니다. 갈비뼈와 주변 조직을 들어 올리는 동안 네 번째갈비뼈와 다섯 번째 갈비뼈 사이의 늑간 공간을 잘라낸 다음 눈꺼풀 리트랙터를 열린 공간에 삽입합니다.
구부러진 집게를 사용하여 회심을 철회하고 폐를 시야에서 위쪽으로 움직입니다. 9-0 나일론 봉합사를 LAD 동맥 아래 심근을 통해 전달 2.5 왼쪽 auricle에 조직의 찢어지거나 주요 혈관을 뚫는 것을 방지하기 위해 부드럽고 일관된 움직임을 유지합니다. 느슨한 사각형 매듭을 묶은 다음 느슨한 매듭 안에 폴리에틸렌 튜브 1 센티미터를 놓습니다.
튜브 주변의 봉합사를 확보하고 창구와 심실 부정맥에 의해 허혈을 확인한 다음 35 분 후에 놓습니다. 튜브를 제거 한 후 심근의 재 관류를 확인하기 위해 5 분 동안 기다립니다. 24 게이지 IV 카테터 튜브를 흉부 구멍 에 넣고 개구부 오른쪽에 하나의 늑간 공간을 배치합니다.
6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 간단한 중단 패턴및 근육 층에서 연속 봉합사 패턴으로 늑간 절개를 닫습니다. 피상적 인 근육 층을 닫은 후 흉부 구멍에서 공기를 1 밀리리터 결핵 주사기로 제거합니다. 연속 수평 매트리스 패턴에 6-0 흡수 봉합사로 피부 절개를 닫습니다.
완료되면, 1.5 밀리리터의 따뜻한 식염수를 피하고 감염을 방지하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다. 마우스를 침구 없는 케이지 또는 따뜻한 패드에 덮인 침구가 있는 케이지또는 완전히 복구될 때까지 섭씨 35~37도의 온도로 마우스를 옮기습니다. 이전에 설명한 대로 마우스를 준비하고 삽관한 후, 가위 및 집게로 피부 층에서 봉합사를 제거한 다음, 숫자 10 메스를 사용하여 이전 수술과 동일한 위치에 절개를 합니다.
근육 층 봉합사가 보일 때까지 흉터 조직을 통해 절단 계속, 다음 봉합사를 제거하고 열린 근육 층을 잘라 가위와 집게를 사용합니다. 함께 갈비뼈를 들고 봉합사를 제거하고 이전 절개에서 늑간 근육을 통해 절단을 계속. 눈꺼풀 리트랙터를 늑간 공간에 넣고 이전 리그레이션 영역을 찾습니다.
로드 300, 000 중간엽 STEM 세포는 PBS의 20 마이크로 리터에서 30 게이지 인슐린 주사기로 중단하고 주입에 대한 적절한 각도를 달성하기 위해 바늘을 약간 구부린다. 정점에서 심장 의 밑쪽으로 이동, 바늘 개구부가 완전히 심근 안쪽에 때까지 페리 -infarct 영역에 주사기를 삽입 한 다음 천천히 심근에 세포를 주입, 3 초 기다렸다 바늘을 제거. 심실 세동과 같은 세포에 비정상적인 반응이 없는지 확인하기 위해 3 분 동안 심장을 면밀히 관찰하십시오.
3분 후, 24 게이지 IV 카테터 튜브를 흉부 구멍 에 1개의 늑간 공간을 개구부 오른쪽에 놓습니다. 늑간 근육과 피부 층을 닫고 이전에 설명한 바와 같이 가슴 튜브를 제거하십시오. 1.5 밀리리터의 따뜻한 식염수를 피하고 감염을 예방하기 위해 절개 부위에 삼중 항생제 연고를 적용한다.
마우스를 침구 없는 케이지 또는 케이지에 옮기고 따뜻한 패드에 덮인 침구가 완전히 복구될 때까지 옮기습니다. 수술 후 심전도 및 심전도는 STEM 세포 이식을 진행하여 경색을 확인하고 심실 수축 기능을 감소시키는 날에 수행되었다. 데이터의 추가 검사는 허혈성 손상을 받은 마우스에서 배출 분획 및 분수 단축이 감소한 반면, 최종 확장기 및 수축기 부피가 증가하였다.
상해 후 7일 심근 조직의 마손 삼크롬 염색은 허혈성 상해를 받은 마우스의 심혼에 있는 좌심실 벽의 증가 콜라겐 증착 및 숱이를 보여주었습니다. 생체 내 생물 발광 화상 진찰 또는 BLI는 중간엽 STEM 세포 이식 후 날에 수행되었다. MSC의 성공적인 전달은 허혈 재관전 손상을 유도했지만 MSC를 받지 못한 마우스에 비해 BLI 신호에 의해 예시된다.
이 프로토콜을 시도할 때, 늑간 을 통해 절단할 때 작은 의도적인 움직임, 혈관을 리칭하고, 세포를 주입하는 것은 시야에서 심장 또는 폐에 과도한 손상을 방지하는 데 필수적이라는 것을 명심하십시오. 이러한 절차는 초음파를 통해 이식 후 심장 기능을 모니터링 할 수있는 기능을 제공합니다, 생물 발광 이미징을 통해 세포 생존 가능성, 또는 사용되는 치료에 따라 추가 분자 또는 생화학 적 기술.
