Ischämische Schäden induzieren eine feindliche pro-inflammatorische Umgebung, die das Überleben transplantierter Zellen beeinflusst. Unser Protokoll stellt eine alternative Methode zur Bereitstellung von Biologika dar, indem die anfängliche Immunantwort auf Verletzungen umgangen wird. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass es es ermöglicht, Therapeutika eine Woche nach der Verletzung zu verabreichen, die Behandlung im klinischen Umfeld imitiert.
Unser Hauptaugenmerk liegt auf dem Ischämie-Reperfusionsverletzungsmodell und der Transplantation von STEM-Zellen. Dieser Ansatz kann jedoch auch für Modelle entzündlicher Erkrankungen genutzt werden, die die Einführung biologischer Therapien beinhalten. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren aller chirurgischen Instrumente.
Wenn mehrere Operationen in einer Sitzung durchgeführt werden sollen, reinigen Sie die Instrumente nach jedem Tier und sterilisieren Sie sie mit einem heißen Perlensterilisator. Analgetik umtragen, das Tier wiegen und das Gewicht in das Beatmungsgerät eintragen. Rasieren Sie die linke Seite der Brust vom Brustbein auf das Niveau der Schulter und wenden Sie Enthaarungscreme an, um überschüssiges Fell zu entfernen.
Um einen Lungenkollaps zu verhindern, halten Sie den positiven Endexiratoriumsdruck bei zwei Zentimetern Wasser für das Ischämie-Reperfusionsverfahren aufrecht und ändern Sie ihn in drei Zentimeter Wasser für die verzögerte Injektion von Zellen. Nach der Anästhesisierung der Maus, intubieren Sie es mit einem 20 Gauge Endotrachealrohr und übertragen Sie es auf ein kontrolliertes Heizkissen, um eine Körpertemperatur von 35 bis 37 Grad Celsius zu halten. Legen Sie die Maus in seitliche Recumbency mit Schädelende auf der linken und kaudalen Ende auf der rechten Seite.
Schrubben Sie den chirurgischen Bereich abwechselnd zwischen Povidon Jod und Alkoholtupfer dreimal und wenden Sie ophthalmologische Salbe auf beide Augen. Verwenden Sie eine Zahl 10 BlattSkalpell, um einen vertikalen Schnitt 2,5 Millimeter rechts von der linken Brustwarze im Sichtfeld zu machen, dann verwenden Sie eine Schere, um die oberflächlichen Muskelschichten zu durchschneiden, bis der interkostale Muskel und die Rippen sichtbar sind. Beim Heben der Rippen und des umgebenden Gewebes durchschneiden Sie den interkostalen Raum zwischen der vierten und fünften Rippe, und legen Sie dann den Augenlid-Retraktor in den offenen Raum ein.
Ziehen Sie das Perikard mit gekrümmten Zangen zurück, bewegen Sie die Lunge nach oben und aus der Sicht. Passieren Sie eine 9-0 Nylon-Nähte durch das Myokard unter der LAD-Arterie 2,5 Millimeter distal zur linken Ohrmuschel, die eine glatte und konsistente Bewegung aufrechterhält, um das Reißen des Gewebes oder das Durchsatz eines großen Blutgefäßes zu verhindern. Binden Sie einen lockeren quadratischen Knoten, dann legen Sie einen Zentimeter Polyethylen-Schlauch in den losen Knoten.
Sichern Sie die Naht um den Schlauch und bestätigen Sie Ischämie durch Pallor und ventrikuläre Arrhythmie, dann nach 35 Minuten loslassen. Nach dem Entfernen der Schläuche, warten Sie fünf Minuten, um die Re-Perfusion des Myokards zu bestätigen. Legen Sie ein 24 Gauge IV Katheterrohr in die Brusthöhle einen interkostalen Raum rechts von der Öffnung.
Verwenden Sie 6-0 resorbierbare Nähte, um den interkostalen Schnitt in einem einfachen unterbrochenen Muster und die Muskelschicht in einem kontinuierlichen Nahtmuster zu schließen. Nach dem Schließen der oberflächlichen Muskelschicht, entfernen Sie das Brustrohr, während Sie die Luft aus der Brusthöhle mit einer ein Milliliter Tuberkulinspritze zurückziehen. Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 6-0 resorbierbaren Naht in einem kontinuierlichen horizontalen Matratzenmuster.
Nach Fertigstellung 1,5 Milliliter warme Salin subkutan verabreichen und dreifache Antibiotikasalbe auf die Schnittstelle auftragen, um eine Infektion zu verhindern. Übertragen Sie die Maus in einen bettenfreien Käfig oder einen Käfig mit überdachter Bettwäsche auf einem warmen Pad und einer Temperatur von 35 bis 37 Grad Celsius, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Nach der Vorbereitung und intubieren die Maus wie zuvor beschrieben, entfernen Sie die Naht aus der Hautschicht mit Schere und Zange, dann verwenden Sie eine Zahl 10 Skalpell, um einen Schnitt an der gleichen Stelle wie die vorherige Operation zu machen.
Schneiden Sie das Narbengewebe weiter, bis die Naht der Muskelschicht sichtbar ist, dann verwenden Sie die Schere und Zange, um die Naht zu entfernen und die Muskelschicht zu schneiden. Entfernen Sie die Nähte, die die Rippen zusammenhalten, und schneiden Sie den Interkostalmuskel aus dem vorherigen Schnitt weiter. Legen Sie den Augenlid-Retraktor in den interkostalen Raum und lokalisieren Sie den Bereich der vorherigen Ligation.
Laden Sie 300.000 mesenchymale STEM-Zellen, die in 20 Mikroliter PBS aufgehängt sind, in eine 30-Spur-Insulinspritze und biegen Sie die Nadel leicht, um den richtigen Injektionswinkel zu erreichen. Bewegen Sie sich in Richtung von der Spitze in Richtung der Basis des Herzens, legen Sie die Spritze in den Peri-Infarkt-Bereich, bis die Nadelöffnung vollständig innerhalb des Myokards ist, dann langsam injizieren die Zellen in das Myokard, warten Sie drei Sekunden und entfernen Sie die Nadel. Beobachten Sie das Herz drei Minuten lang genau, um sicherzustellen, dass es keine abnormale Reaktion auf die Zellen wie Kammerflimmern gibt.
Legen Sie nach drei Minuten ein 24 Gauge IV Katheterrohr in die Brusthöhle einen interkostalen Raum rechts von der Öffnung. Schließen Sie die interkostalen Muskel- und Hautschichten und entfernen Sie das Brustrohr wie zuvor beschrieben. 1,5 Milliliter warmes Salin subkutan verabreichen und dreifache Antibiotikasalbe auf die Schnittstelle auftragen, um eine Infektion zu verhindern.
Übertragen Sie die Maus in einen bettenfreien Käfig oder Käfig mit überdachtem Bettzeug auf einem warmen Pad, bis sie vollständig geborgen ist. Postoperatives Echokardiogramm und Elektrokardiogramm wurden am Tag der mint-Zellimplantation durchgeführt, was infarktikulären und verringerten ventrikulären Kontraktilen die Sendefunktion bestätigte. Weitere Untersuchungen der Daten zeigten, dass die Auswurffraktion und die fraktionale Verkürzung bei Mäusen, die ischämische Verletzungen erhielten, verringert wurden, während das End-Diastolische und systolische Volumen zunahm.
Masson trichrome Färbung des Myokardgewebes sieben Tage nach der Verletzung zeigte erhöhte Kollagenablagerung und Ausdünnung der linken ventrikulären Wand in Herzen von Mäusen, die ischämische Verletzungen erlitten. In vivo biolumineszierende Bildgebung oder BLI wurde am Tag nach der mesenchymalen STAMMzellimplantation durchgeführt. Die erfolgreiche Lieferung von MSCs wird durch das BLI-Signal im Vergleich zu Mäusen veranschaulicht, die eine Ischämie-Reperfusionsverletzung induziert hatten, aber keine MSCs erhielten.
Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass kleine absichtliche Bewegungen beim Durchschneiden der Interkostalen, dem Ligander des Gefäßes und der Injektion von Zellen unerlässlich sind, um übermäßige Schäden am Herzen oder der Lunge im Sichtfeld zu verhindern. Diese Verfahren bieten die Möglichkeit, die Herzfunktion nach der Transplantation durch Ultraschall, Zelllebensfähigkeit durch Biolumineszenz-Bildgebung oder weitere molekulare oder biochemische Techniken je nach therapiebedingter Therapie zu überwachen.
